Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.
1. Имплантация стереотаксической канюли
:
- Используйте 10-12-недельных самцов крыс Спрэг-Доули.
- Обезболивайте животных 1,5-2% изофлураном. Как только животное перестанет реагировать на сильный щипок острыми щипцами, проведите хирургическое вмешательство. Обязательно проведите автоклавирование всех инструментов, используйте стерильные хирургические перчатки, а также добавьте офтальмологическую мазь в глаза животного, чтобы предотвратить повреждение.
- Стереотаксическая имплантация двусторонних направляющих канюль 26-го калибра в префронтальную кору (ПФК) под углом 12,5 градуса с координатами переднезадний (AP): +2,9 мм; медиолатеральный (ML): +/−1,6 мм; дорсовентральный (DV): −2,1 мм. Чтобы вставить канюли, просверлите отверстия в черепе в желаемых координатах, с диаметром отверстия в соответствии с размером используемых канюль.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь PFC изучалась как потенциальная мишень для внутричерепных имплантатов из-за ее важной роли в обработке боли, что было продемонстрировано в ряде предыдущих исследований. Чтобы изучить функцию других конкретных областей мозга, исследователи могут использовать разные координаты в соответствии с атласом мозга. - Дайте крысам восстановиться после операции не менее 1 недели. После операции введите подкожные жидкости перед восстановлением, чтобы поддержать метаболические потребности, и нанесите местный бупивакаин на только что закрытый разрез. Положите животное на теплую подушку до тех пор, пока оно не проснется, и наблюдайте за животным после операции в течение 3 дней, чтобы обеспечить хорошее здоровье и надлежащее восстановление.
- Как только животные полностью оправятся от операции, начните делать инъекции (следующий шаг).
2. Внутричерепные и внутрибрюшинные инъекции
- Для внутричерепных инъекций используйте трубку PE-50, прикрепленную с одного конца к шприцам Hamilton объемом 10 мкл с помощью канюли инжектора 33 калибра, которая выступает на 1,0 мм за пределы имплантируемых направляющих.
- Введите 0,5 мкл (или меньше, если хотите) исследуемого препарата или физиологического раствора в ПФУ этих крыс. Поскольку у крыс ПФУ имеет более крупную область, это количество не будет распространяться на другие регионы. Однако для небольших областей мозга или для мышей используйте меньший объем. Количество вводимого раствора будет зависеть от области мозга и вида животного.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обратите внимание, что в качестве контроля следует использовать физиологический раствор вместо диметилсульфоксида (ДМСО), поскольку ДМСО нейротоксичен. Тем не менее, очень небольшое количество ДМСО может быть безопасным для инфузии, поскольку исследования показали, что менее 50% ДМСО (т.е. менее общего объема 0,3 мкл, как в данном случае) может не мешать поведенческим исследованиям. - Вводите объем двусторонне в течение 100 с и удерживайте канюли инжектора на месте еще 60 с перед удалением, чтобы обеспечить медленную диффузию этого раствора.
- Для изучения синергетических фармакологических эффектов следует проводить совместное применение другого препарата системными методами. В этом случае введите желаемый препарат или контрольную группу внутричерепно и сразу после этого введите дополнительный препарат внутрибрюшинно. Например, в этом исследовании мы изучали синергетические обезболивающие эффекты морфина и ампакинов для проверки аддитивного эффекта. Мы вводили AMPAkine внутричерепно, в сочетании с внутрибрюшинной введением 1 мг/кг морфина (безопасная системная доза).
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется сначала делать внутричерепные инъекции, так как их сложнее выполнить, чем внутрибрюшинные инъекции.
3. Анализы и оценка анальгезии
- Для изучения влияния внутричерепных инъекций на острое болевое поведение у крыс используйте подошвенный тест (тест Харгривза) для расчета латентности отмены в ответ на тепловые раздражители. Аппарат Харгривза фокусирует инфракрасный луч через стеклянную плоскость на лапу крысы; Крыса стоит и свободно перемещается над стеклянной плоскостью. При выполнении теста Харгривза сфокусируйте инфракрасный луч под подошвенной областью лапки крысы.
- Начните с проведения базовых тестов Харгривза перед инъекциями, чтобы установить базовое значение для сравнения.
- Не вводите никаких лекарственных препаратов любого вида до установления исходного значения. Проведите пять хороших испытаний с интервалом в 5 минут. На хорошую пробу указывает четкая отмена, т.е. когда крыса сгибает колено и поднимает ногу вверх и внутрь тела.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что испытания проходят с интервалом в 5 минут, чтобы предотвратить сенсибилизацию крысы. Аппарат Харгривза автоматически записывает время вывода, как только инфракрасный луч прерывается. В результате обязательно сбрасывайте со счетов испытания от передвижения, смещения веса и т.д. Если используется пробная версия со скидкой, подождите 5 минут и повторите пробную версию. - Рассчитайте пороги выбывания, взяв среднее значение из пяти испытаний.
- После получения базового среднего значения начните эксперимент, чтобы получить время отмены после инфузии лекарств. Тесты Харгривза можно проводить через 20-30 минут после внутричерепных инъекций, хотя точное время может зависеть от фармакокинетики конкретных агентов. Это необходимо для того, чтобы крыса усвоила препарат и испытывает его эффекты. Проведите этот эксперимент таким же образом, как и на шаге 3.1.
- Рассчитайте пороги вывода средств, как указано в шаге 3.2.
