$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.
1. Подготовка животного к операции
- Проводите хирургические процедуры в чистом, специально отведенном для этого месте. Автоклавируйте все хирургические инструменты и стерилизуйте с помощью стерилизатора со стеклянными шариками перед операцией.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе используйте мышей FVB на 10-12-й день после рождения (P10-12). Разные возрасты и линии мышей могут быть использованы для удовлетворения потребностей конкретного проекта. Мыши старше P40 могут быть сложными, потому что бычья кость становится тверже. - Обезболивайте мышей с помощью внутрибрюшинной инъекции смеси кетамина гидрохлорида (100 мг/кг), ксилазина гидрохлорида (10 мг/кг) и ацепромазина (2 мг/кг). Начинайте хирургическую подготовку только после того, как животное перестанет реагировать на болезненные раздражители, такие как защемление пальца ноги. При необходимости введите бустерную дозу (одну пятую от первоначальной дозы) анестетического коктейля для восстановления исходной плоскости анестезии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны на этом этапе, потому что большая часть смертности, наблюдаемой в этом возрасте, вызвана передозировкой анестетика. - Покройте глаза животного защитной офтальмологической мазью, чтобы глаза оставались влажными во время анестезии, подавляя рефлекс моргания животного.
- Чтобы предотвратить гипотермию после анестезии, расположите мышь с вытянутой горлышкой на грелке на протяжении всей процедуры, пока она полностью не придет в себя.
- Перед хирургической манипуляцией выбрите левую заушную область машинкой для стрижки и продезинфицируйте 70% этанолом и повидон-йодом.
2. Хирургическая процедура и векторная инъекция
:
- Используйте постаурикулярный доступ для обнажения барабанной буллы. Надрежьте подкожную клетчатку маленькими ножницами, чтобы обнажить постаурикулярную мышцу. После втягивания жировой ткани на заднюю сторону разреза разделите мышцы с правой и левой сторон перпендикулярно разрезу, чтобы обнажить височную кость. Убедитесь, что этот разрез достаточно длинный, чтобы работать комфортно с адекватной визуализацией.
- Перфорируйте барабанную буллу иглой 25 G и при необходимости расширяйте отверстие щипцами, отслаивая кость назад, чтобы обеспечить доступ к базальному повороту улитки, а затем расширяйте достаточно, чтобы визуализировать стапедиальную артерию и круглую оконную мембрану (RWM).
- Аккуратно проколите RWM в центре боросиликатной капиллярной пипеткой. Наблюдайте за оттоком жидкости через RWM в этой точке; Это нормально. Подождите, пока отток стабилизируется (вытекшая жидкость из улитки высушится стерильной фильтровальной бумагой).
ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, держа и продвигая стеклянную иглу, чтобы перфорация RWM была как можно меньше. В зависимости от используемого микроскопа держите пипетки с помощью микроманипулятора или вручную с помощью держателя для пипеток. - Подготовьте пипетки к инъекции с помощью съемника пипеток, так же как подготавливаются пипетки с накладным зажимом. Убедитесь, что диаметр наконечника большой (около 15 мкм в диаметре), чтобы можно было легко дозировать вирус внутрь и наружу.
- Наберите от 1 до 2 мл аденоассоциированных вирусов (AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP или AAV2-GFP) в пипетку для инъекций. После стабилизации оттока (от 5 до 10 минут) введите этот фиксированный объем в барабанную мышцу через то же отверстие, которое ранее было сделано в RWM.