Трансплантация клеток-предшественников интернейронов человеческого происхождения в гиппокамп детеныша мыши

Аннотация

Источник: Gonzalez-Ramos, A., et al., Трансплантация ГАМКергических нейронов человека, полученных из стволовых клеток человека, в ранний постнатальный гиппокамп мыши для смягчения нарушений развития нервной системы. J. Vis. Exp. (2022)

В этом видео демонстрируется стереотаксическая инъекция клеток-предшественников интернейронов человеческого происхождения в гиппокамп генетически модифицированного детеныша мыши с уменьшенным торможением интернейронов с целью восстановления возбуждающе-тормозного баланса.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Трансплантация клеток внутри гиппокампа

ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги в этом разделе выполняются за пределами капюшона для клеточных культур в помещении для животных. Раннюю постнатальную трансплантацию клеток в мозг проводили на Р2 с учетом Р0 в день рождения.

1. Подготовьтесь к эксперименту по трансплантации, выполнив следующие действия.
   1. Автоклавируйте весь хирургический материал или, если это невозможно, стерилизуйте другим утвержденным методом.
   2. Установите инъекционный шприц в держатель без стеклянного капилляра. Промойте иглу водой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Игла должна быть 33 G.
   3. Согните на 90° кончик иглы для введения инсулина 30 г.
   4. Создайте самодельную сцену, похожую на пластилин, для позиционирования щенка с плоской головой (рисунок 1A).
   5. Принесите клетку для мышей вместе с матерью и детенышами, прежде чем готовить что-либо к операции, чтобы позволить им акклиматизироваться к новой среде.
   6. Подготовьте лоток с влажным льдом и пустую клетку с небольшим количеством бумаги для изофлурана.
2. Обезболите мышиного щенка.
   1. Смочите лист бумаги изофлураном (см. Таблицу материалов) и поместите его внутрь пустой клетки. Осторожно возьмите одного щенка и поместите его в клетку с бумагой, смоченной в изофлуране.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Никогда не оставляйте с мамой менее трех щенков. Не превышайте 20-30 с изофлурановой анестезии, иначе щенок может умереть.
   2. Проверьте эффект анестезии путем прекращения движения.
   3. Сразу после анестезии положите щенка на влажную салфетку на поверхность влажного льда. Держите животное на льду в течение 3 минут, пока верхние конечности не станут беловатыми (рисунок 1Б, синяя стрелка). Обычно это занимает 2-3 минуты.
   4. Используйте это время для загрузки шприца клеточной суспензией. Перед этим осторожно подвешивают клетки с помощью пипетки.
   5. Поместите щенка на стереотаксическую рамку. Используйте ушные планки в обратном направлении (Рисунок 1A, пурпурные стрелки).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Задняя сторона ушных ушейных планок менее заострена, и, поскольку у щенков P2 нет ушей, используйте более плоскую сторону, чтобы не причинить вреда животному.
   6. Сбоку проверьте, прямая ли голова. Голова должна быть плоской; используйте стадию, похожую на пластилин, чтобы приспособиться к этому.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Щенки в этом возрасте еще не открыли глаза, поэтому никаких дополнительных шагов в этом отношении предпринимать не нужно. У щенков в этом возрасте нет шерсти, поэтому брить эту область не требуется. Специфическое обезболивание не назначается, так как это не открытый разрез кожи, и не требуется наложение швов.
   7. Держите щенка накрытым на льду (поверх папиросной бумаги) в течение всей операции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не кладите лед в прямой контакт с кожей щенка.
3. Выполните инъекцию.
   1. Очистите поверхность кожи с помощью мягкой ткани, смоченной в этаноле.
   2. Определите лямбду и установите координаты в ноль на цифровом дисплее стереотаксического прибора (рисунок 1C, желтая пунктирная линия). Сагиттальные и лямбдоидные швы хорошо видны глазу, так как они васкуляризированы в виде красных линий.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если вы испытываете трудности с визуализацией лямбды, положите небольшой кусочек льда на кожу и подождите пару минут, пока он остынет. Затем, удалите кусочек льда, и тонкое отбеливание кожи позволит вам визуализировать.
   3. Переместите инъекционную иглу в нужные координаты. В описанном протоколе целевой областью был гиппокамп, а координаты были следующими: передне-задний (AP) +0,85 и медиолатеральный (ML) +1,35.
   4. Используйте изогнутую на 90° инсулиновую иглу, чтобы проникнуть в череп и создать крошечное отверстие.
   5. Опустите иглу для инъекции до тех пор, пока она не пересечет череп, и обнулите дорсо-вентральные (DV) координаты. Опускайте иглу до нужных координат DV. В описанном протоколе координаты были DV −1.1.
   6. Вводите в соответствии с заранее определенными временными интервалами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В описанном протоколе точное время было следующим: (i) после спуска к координате DV подождите 3 минуты, (ii) введите 1 μL объема в течение 5 минут, и (iii) после того, как весь объем будет введен, подождите 3 минуты.
   7. Медленно втяните иглу.
4. Завершите процедуру.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Операция не может длиться более 15 минут, чтобы обеспечить выживание щенка и избежать любых повреждений, вызванных анестезией в результате гипотермии.
   1. Согрейте щенка руками, пока он не начнет двигаться, прежде чем отдать его матери.
   2. Давайте DOX в концентрации 1 мг/мл в 0,5% растворе сахарозы в виде питьевой воды в течение как минимум 2 дней до и 3 недель после трансплантации (ПТ) для продолжения дифференцировки клеток in vivo.

Результаты

Рисунок 1: Теотаксическая трансплантация у новорожденных мышей в P2. (A) Сцена, похожая на пластилин, используется для удержания тела щенка в нужном положении и перевернутых ушных планок (пурпурные стрелки). (...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
30 G игла	B Braun	4656300
33 G игла для шприца Hamilton	Hamilton	7762-06
B6.129(Cg)-Cntnap2tm1Pele/J	Jackson Laboratory	17482	Животная модель
C57BL/6J	Janvier Labs		Животная модель
Цифровой стереотакс	KOPF	Модель 940
Доксициклин	Sigma-Aldrich	D9891	2 мкг/мл
Этанол	Solveco		70%, 95%, 99,8%
H1 (WA01) ESC	WiCell	WA01	Линия эмбриональных стволовых клеток человека в соответствии с соглашением MTA
Hamilton Шприц	Hamilton	7634-01	5 мкл
Изофлуран Baxter	Apoteket AB
Мышиный адаптер к стереотаксу	RWD	68030
Пуромицин (дигидрохлорид)	Gibco	A1113803
Пинцет	VWR