Встроенный в агарозу перенос генов с помощью электропорации в предшественниках корковых интернейронов мышей

1. Focal DNA injections
   1. Приготовьте смесь векторов экспрессии дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК): pCAGGs-IRES-GFP (контрольный вектор) + pCAGGs-hM3D(Gq)-IRES-RFP, в концентрации 1 г/мкл для каждого вектора. Добавьте быстрый зеленый раствор (запас 25 мг/мл) в разведении 1/10.
   2. Заполните стеклянную микропипетку (внутренний диаметр 0,5 мм и внешний диаметр 1 мм) 10 мкл смеси ДНК и введите небольшое количество (в диапазоне 25-50 нл) в выбранную область (медиальная ганглионарная эпигнация или MGE/каудальная ганглионарная или CGE) среза (рис. 1 и рис. 2).
2. Острая электропорация
   ПРИМЕЧАНИЕ: Электропорацию следует проводить сразу после инъекции фокальной ДНК.
   1. Поместите маленький агарозный блок на электрод чашки Петри и прикрепите агарозную колонку к подвижному электроду крышки с помощью микрошпателя с плоским концом.
   2. Перенесите срез с поддерживающей мембраной на агарозный блок и поместите верхний электрод с агарозной колонной поверх выбранной области (MGE/CGE) среза.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Напряжение зарядки 125 В (два импульса по 5 мс каждый, интервал 500 мс) обеспечит успешную электропорацию (Рисунок 3).
3. После электропорации поместите срез с поддерживающей мембраной в чашку и перенесите его в инкубатор для культур тканей CO₂ при температуре 37 °C.

Рисунок 1: Репрезентативные теленцефалические срезы, используемые для экспериментов по острой электропорации. (А-С) Теленцефальные срезы были получены на трех различных последовательных рострокаудальных уровнях, окрашенных 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI). LGE: латеральное ганглионарное возвышение; MGE: медиальная ганглионарная возвышенность; CGE: каудальное ганглионарное возвышение. Масштабные линейки = 200 мкм. Желтыми звездочками обозначено место электропорации в каждом срезе. Белой линией отмечен край ганглионарного возвышения.

Рисунок 2: Схематическое изображение экспериментального рабочего процесса. (А) срезы мозга мыши подвергаются электропорации с помощью соответствующих конструкций, и (В) через 12 ч выделяются модифицированные предшественники корковых интернейронов (КИ) и (В) трансплантируются в паллиум новорожденных детенышей мышей (Р0−Р2). Для модификации активности незрелых ДИ птенцам P14, получившим трансплантацию клеток, вводили ХНО или носитель в течение четырех конститутивных дней в соответствии с представленным протоколом. (А') Фотография установки электропорации среза мозга острой мыши.

Рисунок 3: Репрезентативный успешный эксперимент по острой электропорации. (A) Репрезентативный корональный срез мозга эмбриона E14.5, трансфицированный в CGE плазмидами pCAGGs-IRES-GFP (зеленый флуоресцентный белок) и pCAGGs-hM3D(Gq)-IRES-RFP (красный флуоресцентный белок) и культивируемый в течение 12 ч. Срез был иммуноокрашен на GFP (A, B, C) и RFP (A, B, D). Прямоугольная область на панели A увеличивается, чтобы показать экспрессию как флуоресцентных репортеров (B), GFP (C), так и только RFP (D). Белой линией отмечен край ганглионарного возвышения. B-D: одна и та же фотография, разные каналы или комбинация двух разных каналов. Масштабные линейки = 200 μм (А), 100 μм (В-Г).