Методическая статья

Встроенный в агарозу перенос генов с помощью электропорации в предшественниках корковых интернейронов мышей

7 августа 2025 г.

В этой статье

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Источник: Denaxa, M., el al., Трансплантация хемогенетически модифицированных предшественников кортикальных интернейронов в мозг ранних постнатальных мышей. J. Vis. Exp. (2019)

В этом видео показана процедура введения плазмидного вектора, несущего интересующий ген, в интернейроны-предшественники в эмбриональном срезе мозга с последующей электропорацией для проникновения плазмиды и экспрессии генов. Эти модифицированные предшественники в дальнейшем могут быть использованы для лечения заболеваний головного мозга.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Focal DNA injections
    1. Приготовьте смесь векторов экспрессии дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК): pCAGGs-IRES-GFP (контрольный вектор) + pCAGGs-hM3D(Gq)-IRES-RFP, в концентрации 1 г/мкл для каждого вектора. Добавьте быстрый зеленый раствор (запас 25 мг/мл) в разведении 1/10.
    2. Заполните стеклянную микропипетку (внутренний диаметр 0,5 мм и внешний диаметр 1 мм) 10 мкл смеси ДНК и введите небольшое количество (в диапазоне 25-50 нл) в выбранную область (медиальная ганглионарная эпигнация или MGE/каудальная ганглионарная или CGE) среза (рис. 1 и рис. 2).
  2. Острая электропорация
    ПРИМЕЧАНИЕ: Электропорацию следует проводить сразу после инъекции фокальной ДНК.
    1. Поместите маленький агарозный блок на электрод чашки Петри и прикрепите агарозную колонку к подвижному электроду крышки с помощью микрошпателя с плоским концом.
    2. Перенесите срез с поддерживающей мембраной на агарозный блок и поместите верхний электрод с агарозной колонной поверх выбранной области (MGE/CGE) среза.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Напряжение зарядки 125 В (два импульса по 5 мс каждый, интервал 500 мс) обеспечит успешную электропорацию (Рисунок 3).
  3. После электропорации поместите срез с поддерживающей мембраной в чашку и перенесите его в инкубатор для культур тканей CO2 при температуре 37 °C.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
figure-results-1

Рисунок 1: Репрезентативные теленцефалические срезы, используемые для экспериментов по острой электропорации. (А-С) Теленцефальные срезы были получены на трех различных последовательных рострокаудальных уровнях, окрашенных 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI)....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Medium/Supplements
Neurobasal mediumGIBCO (ThermoFisher Scientific)21103-049Neuron basic medium
Оборудование
ЭлектропораторBTXECM 830 Генератор
Инжектор для электропорации острого срезаEppendorfFemtoJet Микроинъектор
Kite Ручной МикроманипуляторWPIKITE-M3-R
Platinum Elecrode (I)Protech International Inc.CUY-700-1
Платиновый электрод (II)Protech International Inc.CUY-700-2
Стальная опорная плитаWPI5479
Другие материалы
Стеклянные капилляры для электропорацииVWR1B100-4
Чашки для культуры тканей органовBD Biosciences (Falcon)353037

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи