Инъекция рекомбинантных аденоассоциированных векторов в модель мышей со спинальной и бульбарной мышечной атрофией

Аннотация

Источник:
Pourshafie, N., et al. Системная доставка микроРНК с использованием рекомбинантного аденоассоциированного вируса серотипа 9 для лечения нервно-мышечных заболеваний у грызунов. J. Vis. Exp. (2018).

В этом видео мыши, страдающей спинальной и бульбарной мышечной атрофией или SBMA-пораженной мышечной атрофией, подвергается инъекции в хвостовую вену рекомбинантных векторов AAV (аденоассоциированных векторов), несущих плазмиду, кодирующую терапевтическую микроРНК. Вектор продуцирует микроРНК, которая связывается с мутантной АР (андрогенным рецептором)-мРНК (матричной рибонуклеиновой кислотой), запуская ее деградацию. Это снижает накопление токсического белка и способствует улучшению нервно-мышечной функции.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Инъекция плазмиды AAV-miRNA в хвостовую вену

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап требует корректировки в соответствии с геном-мишенью, а также возрастом и весом мышей. Используйте рекомендации Комитета по уходу и использованию животных (IACUC) для определения диапазона доз, объема и наилучшего способа введения в зависимости от возраста и веса мышей. Ожидается, что сигнал флуоресценции GFP (зеленый флуоресцентный белок) и уровни экспрессии микроРНК в тканях-мишенях достигнут пика, начиная с 2 недель после инъекции. Следующий протокол относится к самцам мышей в раннем взрослом возрасте. AAV следует рассматривать как биологически опасный в соответствии с руководящими принципами уровня биобезопасности 1.

1. Разделите плазмидный запас AAV-микроРНК на аликвоты по 100-200 мкл, содержащие вирусную нагрузку 10-10-10¹¹ вирусных геномов на мл (vg/мл), с помощью стерильного фосфатно-солевого буфера (PBS). Для работы с раствором AAV следует использовать лабораторные средства индивидуальной защиты биологически опасных веществ.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После размораживания аликвота может храниться при температуре 4 °C до двух недель. Вирусный запас можно хранить в морозильной камере при температуре -80 °C.
2. Удерживайте мышь в имеющихся в продаже ограничителях, таких как пластиковая или коническая пластиковая пленочная трубка подходящего размера.
3. Очистите поверхность хвоста 70% спиртовыми салфетками.
4. Подержите теплую подушечку (28-30 °C) под хвостом в течение 30 секунд, чтобы усилить расширение сосудов. Как вариант, согреть животных можно с помощью красной тепловой лампы (на расстоянии 2-3 футов) или опустив хвост в теплую воду.
5. Начиная с дистальной части хвоста, введите иглу (27-30 G) с вирусной аликвотой, скошенную вверх, под углом 15° от хвоста, в вену. Перед инъекцией убедитесь, что игла введена правильно.
   1. Если во время инъекции чувствуется сопротивление или под кожей появляется отек, остановите процедуру. Извлеките иглу и снова вставьте ее над местом предыдущей инъекции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы это можно сделать, осторожно отсасывая иглу и наблюдая за кровью. Сильная аспирация может свернуть хвостовую вену. Если во время инъекции вена бледнеет, игла вводится правильно.
6. После того, как инъекция будет завершена, подождите несколько секунд, прежде чем поднимать иглу.
7. Следите за местом укола на предмет кровотечения. Надавите умеренно двумя пальцами на участок до тех пор, пока кровотечение не остановится.
8. Верните животное в клетку.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Scale	Pelouze	SP5
Nalgene bucket	Thermo Scientific	12014000	4000 мл
микроцентрифужная пробирка	США Scientific	1615-5500
Lactated Ringer's Решение	Baxter Healthcare	0338-0114-04
Мини-вортексер	Fisher Scientific	128101
Центрифуга	Eppendorf	22624415
Лабораторная пленка	Bemis	PM996
1-мл шприц	BD	309626	Поставляется с прилагаемой иглой 25 г. Замените на иглу 27-30 г для инъекций
иглу 30 г	BD	305106
Изофлуран	Пирамал Здравоохранение	66794-013-25	Изофлуран USP 250 мл
Маска для анестезии	Kopf Instruments	906
Марля	Henry Schein	100-2524	2" x 2" (5 см x 5 см)
Наконечники для пипеток	США Scientific	1111-0816
Micropipet	Gilson	4642080
Испаритель для газовой анестезии	SurgiVet	4214322	Classic T3
Поглотитель газовой анестезии	SurgiVet	32373B10	Enviro-PURE
Грелка	Sears	17280
Скамья	VWR	56617-006
Rotarod	Panlab/ Harvard Apparatus	76-0772	4 крысы / 4 мыши
с 70% этанолом	Decon Laboratories, Inc.	2401	140 пруф
70% изопропанол	VWR	89108-160