Внутричерепная инъекция микробных метаболитов кишечного происхождения в мышиную модель

Аннотация

Источник: Liou, C. et al. Внутримозговая доставка микробных метаболитов кишечного происхождения у свободно движущихся мышей. J. Vis. Exp. (2022).

В этом видео демонстрируется внутричерепная инъекция короткоцепочечных жирных кислот (КЦЖК) свободно движущейся мыши для изучения их влияния на поведение, опосредованное мозгом. Инжекторная канюля вставляется в направляющую канюлю, имплантированную в мозг мыши. После выздоровления мышь акклиматизируется в новой клетке. Затем вводятся КЦЖК и регистрируется локомоторное поведение.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Подготовка к экспериментальному животному

1. Получите у продавца 6-8-недельных мышей дикого типа C57BL/6JНарл самцов мышей.
2. Поместите мышей в стандартную клетку для мышей со стандартным мышиным кормом и стерилизованной водой в неограниченном количестве.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Условия содержания в Центре лабораторных животных составляют 22 ± 1 °C, влажность 55% ± 10% и цикл свет/темнота 13 ч/11 ч.

2. Стереотаксическая хирургия

1. Подготовьте и простерилизуйте стереотаксический инструмент, хирургические инструменты и связанные с ними предметы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все предметы, которые будут непосредственно контактировать с местом операции, должны быть стерилизованы во избежание инфекции.
2. Обезболите мышь, поместив ее в клетку из плексигласа с 1%-5% изофлураном в кислороде.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Внимательно наблюдайте за мышью, чтобы убедиться, что частота дыхания поддерживается на уровне около одного вдоха в секунду.
3. Выньте мышь из анестезиологической камеры. Выбрейте место операции (голову мыши) с помощью триммера для домашних животных. Поместите мышь на стереотаксическую рамку, закрепив резцы мыши на планке резцов в держателе стереотаксического резца. Закройте нос маской из носового конуса.
4. Обезболивайте мышь 1%-2,5% изофлураном в кислороде на протяжении всей стереотаксической операции. Оцените ноцицепцию мыши с помощью рефлекса щипкового пальца ноги и обеспечьте постоянную частоту дыхания перед разрезом в месте операции.
5. Поместите грелку (37,0 °C) под мышь на стереотаксическую рамку для поддержания температуры тела во время операции. В качестве альтернативы можно поддерживать температуру тела с помощью ректального термозонда, соединяющего запрограммированный обогреватель и грелку.
6. Снимите подстриженный мех на голове с помощью скотча. Введите мышке обезболивающий кетопрофен (5 мг/кг) подкожно, чтобы облегчить боль. Наносите мазь для глаз, чтобы избежать сухости глаз.
7. Вставьте заостренную ушную планку в ушной канал, чтобы зафиксировать голову.
8. Центрируйте голову, регулируя масштаб ушной планки.
9. Затяните носовой зажим на держателе резцов, чтобы избежать вертикального смещения. Осторожно нажмите на головку, чтобы убедиться, что головка зафиксирована, и избежать ее ослабления во время последующей операции.
10. Продезинфицируйте кожу головы тремя чередующимися скрабами хлоргексидина с помощью ватного тампона. Начинайте каждый скраб с середины на внешнюю сторону (от наиболее дезинфицируемой центральной области к наименее дезинфицируемой области).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Использование скрабов от середины к внешней стороне может помочь ученым свести к минимуму инфекцию и загрязнение от шерсти. Внешняя область находится близко к небритой области головы, которая все еще покрыта большим количеством шерсти и ее нелегко тщательно продезинфицировать.
11. Надрез волосистой части головы спереди/сзади (<1 см) с помощью хирургического лезвия. Откройте разрез и протрите череп ватным тампоном, удерживаемым микрорассекающими щипцами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Микрорассекающие щипцы, хирургическое лезвие и ватные палочки должны быть стерилизованы путем автоклавирования перед операцией. Во время хирургического процесса стерилизуйте все хирургическое оборудование с помощью стерилизатора со стеклянными шариками (150 °C) в течение не менее 5 секунд до и после каждого животного. Подготовьте стерилизованный стакан для удержания хирургического лезвия и щипцов во время хирургического процесса и между животными.
12. Определите Bregma и Lambda на черепе. Используйте Брегму в качестве ссылки для определения местоположения интересующего региона.
    1. Необязательно: Установите стереотаксическое сверло на держатель стереотаксического сверла и используйте кончик сверла, чтобы указать на Брегму в качестве ориентира. Стерилизуйте стереотаксическое сверло с помощью стерилизатора со стеклянными шариками (150 °C) в течение не менее 5 секунд.
13. Откалибруйте и выровняйте горизонтальную плоскость плоского черепа в левой/правой и передней/задней плоскостях с помощью Bregma/Lambda.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если это не в правильной горизонтальной плоскости, снова установите мышь на стереотаксический инструмент.

3. Коммерческая имплантация канюли по индивидуальному заказу

1. Определите и пометьте положение правого бокового желудочка на основе стереотаксических координат: Расстояние до Bregma, передний/задний (A/P): 0,26 мм, медиальный/латеральный (M/L): -1,0 мм, дорсальный/вентральный (D/V): -2,0 мм.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Координаты могут быть изменены в зависимости от интересующей области. Координаты бокового желудочка были основаны на взрослых мышах C57BL/6J с диапазоном веса 26-30 г.
2. Просверлите отверстие (диаметр = 1,5 мм) в черепе в отмеченном месте с помощью стереотаксического сверла для имплантации коммерческой направляющей канюли.
3. Просверлите еще два-четыре отверстия (диаметр = 1,5 мм) на черепе с помощью стереотаксического сверла для крепления винтов из нержавеющей стали.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Стерилизуйте стереотаксическое сверло с помощью стерилизатора со стеклянными шариками (150 °C) в течение не менее 5 секунд до и после каждого животного.
4. Протрите обрывки костей и остановите кровотечение ватным тампоном.
5. Протрите череп лидокаином (1 мг/кг) ватным тампоном для местного обезболивающего, противозудного и обезболивающего эффекта. Если кровотечение не останавливается после сверления, аккуратно положите ватный тампон на отверстие для гемостаза.
6. Установите от двух до четырех винтов из нержавеющей стали на отверстия, чтобы обеспечить анкеры для стоматологического акрила.
7. Поместите коммерческую направляющую канюлю на держатель стереотаксической канюли и продезинфицируйте ее с помощью стерилизатора для стеклянных шариков (150 °C).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Коммерческая направляющая канюля, коммерческий манекен и коммерческий инжектор (Рисунок 1A) были изготовлены по индивидуальному заказу в соответствии со спецификациями, указанными в Таблице материалов.
8. Переместите держатель стереотаксической канюли к отверстию, просверленному для бокового желудочка, и медленно введите коммерческую направляющую канюлю в отверстие до желаемой глубины (2,5 мм).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Дорсальная/вентральная координата может быть определена путем установки кончика коммерческой направляющей канюли в качестве исходного, когда кончик едва вставлен в отверстие.
9. Нанесите 10 мкл клея n-бутилцианоакрилата (тканевый адгезивный клей) для фиксации коммерческой направляющей канюли в просверленном отверстии и подождите 3-4 мин. Осторожно освободите коммерческую направляющую канюлю от стереотаксического держателя канюли и отодвиньте держатель.
10. Нанесите стоматологический акрил на надрезанную кожу головы, чтобы зафиксировать канюлю коммерческого направляющего, и подождите не менее 5 мин. Имплантируйте коммерческий манюль в канюлю коммерческого направляющего, чтобы избежать засорения канюли кровью или биологической жидкостью (Рисунок 1B).
11. Освободите ушную планку от слухового прохода и извлеките мышь из стереотаксической рамки.
12. Поместите мышь в новую клетку, положив под нее грелку для восстановления после анестезии, и непрерывно наблюдайте, пока мышь полностью не проснется.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не оставляйте животное без присмотра до тех пор, пока оно не придет в сознание, достаточное для поддержания лежачего положения на грудине. Животное, перенесшее операцию, не должно возвращаться в компанию других животных до полного выздоровления.
13. Верните мышь в одноместное или групповое содержание, в зависимости от протокола Комитета по уходу за животными и их использованию (IACUC) и плана эксперимента. При групповом содержании убедитесь, что в клетке содержится меньше мышей, чтобы свести к минимуму нежелательные травмы или отслоение канюли.
14. Вводите ибупрофен (0,2 мг/мл) в питьевую воду в течение не менее 3 дней для послеоперационного ухода и контролируйте два раза в день признаки боли и дистресса в течение не менее 3 дней.
    1. Во время послеоперационного ухода наносите мазь с рокситромицином вокруг кожи, чтобы предотвратить воспаление и инфекцию у мышей.
    2. Продолжайте следить за состоянием животного и своевременно вводите внутрибрюшинные инъекции 5% глюкозы и/или 0,9% хлорида натрия для обеспечения достаточного количества энергии.
    3. Если состояние боли, дистресса или инфекции неуклонно ухудшается, усыпьте мышь с помощью ингаляции CO₂.
15. Подождите 1 неделю после операции, чтобы мышь была готова к внутримозговой доставке короткоцепочечных жирных кислот (КЦЖК) и поведенческому тестированию.

4. Получение КЦЖК

1. Растворите ацетат натрия, бутират натрия и пропионат натрия в искусственной спинномозговой жидкости (АКЦФ) (см. Таблицу материалов).
2. Убедитесь, что химические вещества полностью растворены, затем отрегулируйте pH до 7,4 и отфильтруйте смесь КЦЖК через фильтр 0,22 мкм для стерилизации.

5. Настройка инфузионной системы для внутримозговой доставки КЦЖК во время поведенческого тестирования

1. Установите потолочную камеру для записи поведения. Подключите камеру к компьютеру для управления программным обеспечением для записи видео (рис. 2).
2. Наполните шприц объемом 10 мкл дистиллированной водой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте попадания пузырьков воздуха в микролитровый шприц.
3. Подключите насос микровпрыска к контроллеру микровпрыска
.
4. Установите микролитровый шприц на микроинъекционный насос. Чтобы установить шприц, нажмите кнопку, чтобы ослабить зажим и установить шприц в соответствующее положение. Закройте зажим и затяните винт, удерживающий поршень, на микронасосе впрыска (Рисунок 3A).
5. Вставьте коммерческий инжектор в полиэтиленовую трубку (рис. 1A).
6. Повесьте полиэтиленовую трубку на потолочную камеру над испытательной ареной.
7. Наполните полиэтиленовую трубку дистиллированной водой с помощью инсулинового шприца. Подсоедините микролитровый шприц к подвешенной полиэтиленовой трубке.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что полиэтиленовая трубка достаточно длинная, чтобы мышь могла свободно перемещаться по испытательной арене.

6. Системные настройки контроллера микровпрыска

1. Включите контроллер микровпрыска и нажмите «Показать все каналы» для доступа к экрану команд (рис. 3C). Нажмите Конфигурация и установите целевой объем на 9 800 нл со скоростью подачи на 100 нл/с. Влейте 9 800 нл дистиллированной воды из полиэтиленовой трубки, подключенной к микролитровому шприцу (нажмите Direction, чтобы переключиться в режим Infuse, и нажмите RUN) (см. красные квадраты на экране команд на рисунке 3C).
2. Нажмите кнопку Конфигурация и установите целевой объем на 3 000 нл, а скорость подачи — на 100 нл/с. Влейте 3 000 нл минерального масла (нажмите Direction, чтобы переключиться в режим Draw, и нажмите RUN) (см. красные квадраты на экране команд на рисунке 3C).
   ПРИМЕЧАНИЕ: На полиэтиленовой трубке должно наблюдаться четкое разделение фаз масла и воды.
3. Разберите полиэтиленовую трубку от микролитровой иглы шприца. Выплюйте 3 000 нл дистиллированной воды из микролитровой иглы шприца (нажмите Direction, чтобы переключиться в режим Infuse, и нажмите RUN).
4. Вставьте микролитровый шприц обратно в полиэтиленовую трубку. Нажмите Конфигурация и установите целевой объем на 9 500 нл со скоростью доставки 100 нл/с. Извлеките 9 500 нл SCFA (нажмите Direction, чтобы переключиться в режим Draw, и нажмите RUN). Пометьте фазу масла и КЦЖК, чтобы убедиться в успешном введении КЦЖК.
5. Нажмите Конфигурация и установите желаемый целевой объем со скоростью доставки на 7 нл/с. Нажмите Направление, чтобы переключиться в режим инфузии (см. красные квадраты на экране команд на рисунке 3C).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Определите объем на основе времени инфузии. Например, если время инфузии составляет 3 мин при скорости доставки 7 нл/с, целевой объем = 1260 нл.
6. Нажмите RUN, чтобы ввести микролитровый шприц вперед, пока жидкость не выйдет на переднем конце коммерческого инжектора, прежде чем вставлять инжектор в канюлю для инъекции SCFA.

7. Инфузия КЦЖК в боковой желудочек через коммерческую направляющую канюлю у свободно движущейся мыши

1. Обезболите мышь, поместив ее в клетку из плексигласа с 1%-5% изофлурана в кислороде.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Внимательно наблюдайте за мышью, чтобы убедиться, что частота дыхания поддерживается на уровне около одного вдоха в секунду.
2. Загрифуйте мышь и вставьте коммерческий инжектор в канюлю коммерческого направляющего (Рисунок 3B).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если канюля коммерческого проводника забита кровью или биологической жидкостью, аккуратно очистите ее пинцетом.
3. Дайте мыши восстановиться после анестезии в течение 15 минут в клетке перед поведенческим тестированием.
4. Для базового теста на локомоцию поместите мышь в новую клетку и дайте ей свободно исследовать ее в течение 35 мин. Введите SCFA, используя скорость доставки 7 нл/с для целевого объема 2 100 нл в течение первых 5 минут (нажмите направление в режим Infuse и нажмите RUN).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Передвижение в новой клетке можно анализировать с помощью программного обеспечения для видеослежения за поведением животных.
5. Обезболите мышь (повторите шаг 7.1) и извлеките коммерческий инжектор из канюли коммерческого направляющего.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мышь может быть многократно введена с различными контрольными элементами/метаболитами после того, как будет предоставлен соответствующий период времени для вымывания предыдущей инъекции. До тех пор, пока канюля закреплена на голове мыши, мышь может быть многократно протестирована на различные метаболиты.

8. Восстановление системы микроинъекций

1. : Разберите полиэтиленовую трубку от микролитрового шприца.
2. Введите воздух в трубку с помощью инсулинового шприца, чтобы сбросить дистиллированную воду из полиэтиленовой трубки. Опорожните микролитровый шприц.
3. Нажмите кнопку «Сбросить позы» на экране «Конфигурация», чтобы открыть экран определения фигурки упора шприца (рисунок 3C).
4. Нажимайте кнопку «Снять» до тех пор, пока не раздастся звуковой сигнал, чтобы сбросить насос микровпрыска в полностью выведенное положение (Рисунок 3C).
5. Вернитесь на экран команд и выключите контроллер микроинжекции, если на этом экране есть знак **END REACHED** (рис. 3C).

Результаты

Рисунок 1: Имплантация коммерческой направляющей канюли мышам. (A) Репрезентативное изображение канюли, манекена и инжектора коммерческого направляющего. (В) Репрезентативное изображение коммерческой направляющей канюли и манекена, имплантир...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Material
Advil Liqui-Gels Solubilized Ibuprofen A2:D41	Pfizer	n/a
Вакуумный фильтр для бутылки, 500 мл, 0,22 мкм, PES, Sterile	NEST	121921LA01
CaCl₂	Sigma-Aldrich	C1016	ACSF: 0,14 г/л
Хлоргексидиновый скраб 2%	Phoenix	NDC 57319-611-09
Раствор хлоргексидина	Phoenix	NDC 57319-599-09
Коммерческий пустышка	RWD Life Science	62004	Single_OD 0,20 мм/ M3,5/G = 0,5 мм
Коммерческая направляющая канюля	RWD Life Science	62104	Single_OD 0,41 мм-27G/ M3.5/C = 2.5 мм
Коммерческий инжектор	RWD Life Science	62204	Single_OD 0.21 мм-33G/ Сопрягается с M3.5/C = 3.5 мм/G = 0.5 мм
D-(+)-глюкоза	Sigma-Aldrich	G8270	ACSF: 0.61 г/л
Стоматологический акрил	HYGENIC	н/д
Крепежные винты	RWD Life Science	62521
Лошадиная сыворотка	ThermoFisher Scientific	16050130
Инсулиновые шприцы	BBraun	XG-LBB-9151133S-1BX	1 мл
Изофлуран	Панион & BF biotech	DG-4900-250D
KCl	Sigma-Aldrich	P3911	ACSF: 0,19 г/л
Кетопрофен	Swiss Pharmaceutical	н/д
Лидокаин	AstraZeneca	н/д
Низкая температура плавления агарозы	Invitrogen	16520
MgCl₂	Sigma-Aldrich	M8266	ACSF: 0,19 г/л
Предметные стекла Микроскопа	ThermoFisher Scientific	4951PLUS-001E
Минеральное масло светлое, белое NF	Macron Fine Chemicals	MA-6358-04
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888	ACSF: 7,46 г/л
₂PO₄	Sigma-Aldrich	S8282	ACSF: 0,18 г/л
NaHCO₃	Sigma-Aldrich	S5761	ACSF: 1,76 г/л
n-бутилцианоакрилатный клей (тканевый адгезивный клей)	3M	1469SB	3M Vetbond
Neural Tracer	Santa Cruz	SC-358883	FluoroGold
Параформальдегид	Sigma-Aldrich	P6148
Полиэтиленовая трубка	RWD Life Science	62329	OD 1.50, I.D 0.50 мм и OD 1.09, I.D 0.38 мм
Puralube Vet (глаз) Мазь	Dechra	12920060
ацетата натрия	Sigma-Aldrich	S2889	SCFAs: 13.5 мМ
Азид	натрия Sigma-Aldrich	S2002
Бутират натрия	Sigma-Aldrich	B5887	SCFAs: 8 мМ
Пропионат натрия	Sigma-Aldrich	P1880	SCFAs: 5,18 мМ
Направляющая канюля из нержавеющей	стали Chun Ta нержавеющая сталь предприятия CO., LTD.	н/д	наружный диаметр 0,63 мм; Местный поставщик
нержавеющего инжектора	Chun Ta предприятие из нержавеющей стали CO., LTD.	н/д	наружный диаметр 0,3 мм; манекен изготовлен из инжектора; местный производитель
Superglue	Krazy Glue	KG94548R
Triton X-100	Merck	1.08603.1000
Оборудование Держатель
канюли	RWD Life Science	B485-68217
Потолочная камера	FOSCAM	R2
Цифровые стереотаксические инструменты	Stoelting	51730D
Препарирующий микроскоп	INNOVIEW	SEM-HT/TW
Стерилизатор стеклянных шариков	RWD Life Science	RS1501
Грелка	Stoelting	53800M
Микрорассекающие щипцы	ROBOZ	RS-5136	зубчатый, слегка изогнутый; Экстра нежный; ширина наконечника 0,5 мм;
Микрорассекающие ножницы	ROBOZ	RS-5918	4,5 дюйма Угловой острый
микроинъекционный контроллер	World Precision Instruments (WPI)	MICRO2T	Контроллер SMARTouch
Микроинъекционный шприцевой насос	World Precision Instruments (WPI)	UMP3T-1	UltraMicroPump3
Микролитровый шприц	Hamilton	80014	10 μL
Оптическое волокно Холодный свет с двойным оптоволоконным	шагом	LGY-150	Местный поставщик
Триммер для домашних животных	WAHL	09962-2018
Программное обеспечение
Программное обеспечение для видеослежения за поведением животных	Noldus	EthoVision	Версия: 15.0.1416

длиной 4 дюйма