Шванновские клеточные кондуиты для регенерации аксонов после травмы спинного мозга

Аннотация

Источник: Lee, Y., et.al. Трансплантация шванновских клеток внутри кондуитов PVDF-TrFE для моста через пересеченные культи спинного мозга крысы для содействия регенерации аксонов через разрыв. J. Vis. Exp. (2017)

В этом видео демонстрируется использование пьезоэлектрического полимерного канала, засеянного шванновскими клетками, для стимуляции регенерации аксонов в пересеченном спинном мозге крысы. Канал обеспечивает структурное руководство, а его биоэлектрические свойства стимулируют рост нейритов. Шванновские клетки внутри кондуита секретируют нейротрофические факторы, поддерживая аксональный мостик между ростральными и каудальными культями.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были проверены местным комитетом по уходу за животными и ветеринарной экспертной комиссией JoVE.

1. Пересечение в T8

1. Разместите втягивающее устройство вокруг T7 до T9. После того, как все пластинки будут удалены, убедитесь, что промежутки между поперечными отростками видны, особенно в точке Т8. Также исследуйте кости по длине с обеих сторон от T7 до T9, чтобы убедиться в отсутствии костных фрагментов, выступающих наружу.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот зазор в T8 важен для выполнения полного пересечения. Позвонки по всей длине должны быть удалены для более легкого введения кондуита.
2. Обрежьте спинные и брюшные корни выше и ниже T8 с помощью наклонных пружинных ножниц. Добавьте физиологический раствор в спинной мозг и подождите, пока кровь свернется.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг важен для правильного введения кондуита.
3. Поместите наклонные пружинные ножницы над спинным мозгом в промежутки между поперечными отростками в точке Т8 и сделайте один надрез, чтобы полностью разорвать спинной мозг. Поместите небольшой кусочек спрессованной пены в образовавшийся зазор в 2-2,5 мм и сразу же добавьте в область физраствор

.

2. Conduit insertion

1. Пока ждете, пока обрубленные обрубки пуповины достигнут гемостаза, выньте кабелепровод из 1x PBS. Разрежьте абсорбционные треугольники на тонкие длинные кусочки и поместите их в кабелепровод, чтобы удалить излишки PBS. Убедитесь, что предварительно вырезанные окна открыты.
2. Удалите физиологический раствор и кровь с помощью тонких длинных кусочков абсорбционных треугольников. Поднимите две культи спинного мозга с помощью микрошпателя, чтобы обеспечить хорошее разделение. Осторожно поднимите ростральный пень с помощью микрошпателя и наденьте трубу на пень окнами к себе. Убедитесь, что вставлена вся культя и нет избыточного кровотечения в кабелепроводе.
3. Осторожно поднимите хвостовой культю и проденьте другой конец кабелепровода через пень. Убедитесь, что вставлен весь пень, а окна находятся на спинной поверхности (рисунок 1А).

3. Шванновская клетка (SC) / Инъекционная матрица Подготовка и инъекция

1. Ожидая, пока разорванный канатик достигнет гемостаза, удалите среду над гранулой GFP-SC. Ресуспендируйте GFP-SC в 10 мкл холодного DMEM/F12. Добавьте в клеточную суспензию 10 мкл холодного инъекционного геля и хорошо перемешайте путем повторного пипетирования. Держите смесь GFP-SC/DMEM/F12/инъекционной матрицы на льду до тех пор, пока не будет завершено введение кондуита.
2. Убедившись, что окна на дорсальной поверхности открыты (рис. 1A), введите 20 мкл смеси GFP-SC/DMEM/F12/injectable matrix в канал через одно из предварительно вырезанных окон с помощью загрузочного наконечника Western Blot и микропипетки. Если смесь SC/DMEM/F12/инъекционная матрица должна переполнить кабелепровод, удалите излишки с помощью треугольников поглощения. Закрыть окна после инъекции; наложение швов не требуется (рисунок 1В).

Результаты

Рисунок 1: Закрытие окна после внедрения SC/DMEM/F12/матрицы. Окна открываются откидыванием каждой створки после размещения трубопровода между ростральными и каудальными пнями (А). После впрыска окна закрываются (B

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Модифицированная среда Dulbecco's Eagle': питательная смесь F-12	ThermoFisher Scientific	11039-021	"DMEM/F12" в протоколе.
Самка крысы Fischer (160-180г)	Ножницы Envigo
Vannas, прямые	FST	15018-10
Micro Spatula	FST	10089-11	Можно выбрать любую марку.
Изогнутые ножницы с тупым концом	FST	14017-18	могут быть любой марки по выбору.
Тупые щипцы	FST	11006-12	могут быть любой марки на выбор.
Rongeur	FST	16121-14	может быть любой марки по выбору.
Ножницы с угловой пружиной	FST	15006-09	могут быть любой марки по выбору.
Абсорбционные треугольники	FST	18105-03	могут быть любой марки по выбору.
Гель-пена	Henry Schein	9083300	"Пена прессованная" в протоколе.
#10 Лезвия	Sklar	06-3010	Можно выбрать любую марку.
Matrigel	Corning	354234	Инъекционная матрица» в протоколе.