Method Article

Применение Мышь лигируют Патч Пейера Кишечные Пробирной Loop для оценки бактериальной поглощение М клетки

DOI:

10.3791/3225

December 17th, 2011

In This Article

Summary

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

М клеток в специализированные фолликула связанных эпителия покрытие Пейеровы бляшки играют важную роль для слизистой иммунологического в кишечнике-лимфоидной ткани. Здесь мы описали метод оценки бактериального трансцитоза клетками М В естественных условиях. Этот метод предоставляет способ понять М-клеток в иммунной системе.

Abstract

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Внутри нашего кишечнике обитает огромное количество синантропных бактерий. Поверхности слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта постоянно подвергаются им, а иногда и к патогенам. Кишкой лимфоидной ткани (GALT) играют ключевую роль для индукции иммунного ответа слизистой оболочки к этим микробам 1, 2. Чтобы инициировать иммунный ответ слизистой оболочки, слизистой оболочки антигены должны быть перевезены из просвета кишечника через эпителиальный барьер в организованных лимфоидных фолликулов, такие как патчи Пейера. Этот антиген трансцитоза опосредовано специализированные эпителиальные клетки M 3, 4. М клетки атипичных эпителиальных клеток, которые активно фагоцитируют макромолекул и микробов. В отличие от дендритные клетки (ДК) и макрофаги, которые ориентированы на антигены в лизосомы для деградации, М клетки главным образом transcytose внутренним антигенам. Это энергичные трансцитоза макромолекулярных через ячейки M обеспечивает антиген к основной организованной лимфоидных фолликуловг, как полагают, необходимо для начала антиген-специфического иммунного ответа слизистой оболочки. Однако молекулярные механизмы, использующие этот антиген поглощение клетками М известно мало. Ранее мы уже сообщали, что гликопротеин 2 (GP2), особенно выраженные на апикальной мембране плазмы М клетки среди энтероцитов, служит рецептором для transcytotic подмножество синантропных и патогенных энтеробактерий, в том числе кишечной палочки и сальмонеллы enterica серовар Typhimurium (S. Typhimurium ), признав FimH, компонента типа я пили на бактериальные наружной мембраны 5. Здесь мы представляем метод применения патча мыши Пейера кишечного анализа цикла для оценки бактериальной поглощение клетками M. Этот метод является улучшенной версией мыши кишечная петля анализа описанных выше 6, 7. Улучшение точек таковы: 1. Изофлюрана был использован в качестве анестетика. 2. Примерно в 1 см лигируют кишечного включая циклПатч ING Пейера была создана. 3. Бактерии рассмотрен клетки М были помечены флуоресцентно флуоресценции реагента маркировки или гиперэкспрессией флуоресцентного белка, такие как зеленый флуоресцентный белок (GFP). 4. М клеток фолликула связанных эпителия покрытие патч Пейера были обнаружены целые монтажа immunostainig с анти антитела GP2. 5. Флуоресцентные бактериальных трансцитоза клетками М наблюдались с помощью конфокальной микроскопического анализа. Патч мыши Пейера кишечного анализа цикла может дать ответ какую комменсальной или патогенных бактерий трансцитоз клетками М, и может привести нам понять молекулярный механизм, как стимулировать иммунную систему слизистой оболочки через ячейки M.

Protocol

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка бактериальных клеток

  1. Подряд глицерина заполненный люминесцентные бактерии (например, GFP выражения S. Typhimurium) на LB агар пластины, содержащей 100 мкг / мл ампициллина.
  2. Культура одну колонию из LB агар на ночь в 2 мл новая среда LB.
  3. Добавить 0,5 мл бактериальной культуры в 4,5 мл питательной среды LB и инкубировать до оптической плотности 1,0 при 600 нм достигается.
  4. Урожай бактериальных клеток путем центрифугирования (3000 мкг, 5 мин, 4 ° С).
  5. Удалите супернатант и мыть два раза с 5,0 мл стерильного фосфатного буфера физиологический раствор (PBS).
  6. Ресуспендируют бактериальных грану....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Инкубационный период патча лигируют Пейера с бактериальной суспензии, как правило, в течение 1 часа наблюдать бактериальный включения в клетках M. В случае 4 часа инкубации, бактерии часто обнаруживаются в зоне Т-клеток патчей Пейера. Как испаряются изофлуран анестезии ингаляционными мог держать мышей стабильной, времени инкубации патч лигируют Пейера с бактериальной суспензии продолжается до наблюдать бактерии, которые перемещаются в Т-клеточной зоны в патче Пейера. Важным моментом этого эксперимента состоит, что.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgements

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы хотели бы поблагодарить всех членов ЕИБ для развития этой техники. Работа выполнена при частичной поддержке гранта-в-помощь для научных исследований в приоритетных областях "Мембрана Трафик" (HO), и "Матрица инфекционных явлений" (KH), молодых ученых (С. Ф. и KH), а также научных исследований (HO ), а также научных исследований в инновационных областях "Внутриклеточное логистика" (HO), от Министерства образования, культуры, спорта, науки и технологий Японии.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Название реагента Компания Номер по каталогу Комментарии (необязательно)
LB-агар Ампициллин
100
SIGMA L5667
Cy3 моно-реактивного
Dye обновления
GE Healthcare PA23001
Alexa Fluor 350
карбоновые кислоты,
сукцинимидил эфир
Invitrogen A10168
Ингаляционный наркоз
аппарат
Синано Seisakusho SN-487
Фиксация и
Пермеабилизации
Решение
BD 554722
Антивирус мыши
Гликопротеина 2
антитело
MBL D278-3 200-кратного разбавления (5μg/ml)
Коза Anti-IgG крысы,
Р (аЬ ') 2-фрагмент
конкретный
Джексон
ImmunoResearch
112-505-006 200-кратного разбавления (20μg/ml)
Alexa Fluor 633
Фаллоидином
Молекулярные зонды A22284 50-кратное разбавление
Конфокальной лазерной
растровый микроскоп
Leica Microsystems DMIRE2
DeltaVision
Восстановление
деконволюция
микроскоп
Прикладная Precision Основные DeltaVision

References

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fagarasan, S., Honjo, T. Intestinal IgA synthesis: regulation of front-line body defences. Nat. Rev. Immunol. 3, 63-72 (2003).
  2. Hapfelmeier, S. Reversible microbial colonization of germ-free mice reveals the dynamics of IgA immune responses. Scienc....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

M CellsPeyer s PatchBacterial UptakeIntestinal Loop AssayConfocal MicroscopyGp2 AntibodyFluorescent BacteriaMucosal ImmunityStromal Vascular FractionCell Isolation

Related Articles