Применение Мышь лигируют Патч Пейера Кишечные Пробирной Loop для оценки бактериальной поглощение М клетки

Summary

М клеток в специализированные фолликула связанных эпителия покрытие Пейеровы бляшки играют важную роль для слизистой иммунологического в кишечнике-лимфоидной ткани. Здесь мы описали метод оценки бактериального трансцитоза клетками М В естественных условиях. Этот метод предоставляет способ понять М-клеток в иммунной системе.

Abstract

Внутри нашего кишечнике обитает огромное количество синантропных бактерий. Поверхности слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта постоянно подвергаются им, а иногда и к патогенам. Кишкой лимфоидной ткани (GALT) играют ключевую роль для индукции иммунного ответа слизистой оболочки к этим микробам ^{1, 2.} Чтобы инициировать иммунный ответ слизистой оболочки, слизистой оболочки антигены должны быть перевезены из просвета кишечника через эпителиальный барьер в организованных лимфоидных фолликулов, такие как патчи Пейера. Этот антиген трансцитоза опосредовано специализированные эпителиальные клетки M ^{3, 4.} М клетки атипичных эпителиальных клеток, которые активно фагоцитируют макромолекул и микробов. В отличие от дендритные клетки (ДК) и макрофаги, которые ориентированы на антигены в лизосомы для деградации, М клетки главным образом transcytose внутренним антигенам. Это энергичные трансцитоза макромолекулярных через ячейки M обеспечивает антиген к основной организованной лимфоидных фолликуловг, как полагают, необходимо для начала антиген-специфического иммунного ответа слизистой оболочки. Однако молекулярные механизмы, использующие этот антиген поглощение клетками М известно мало. Ранее мы уже сообщали, что гликопротеин 2 (GP2), особенно выраженные на апикальной мембране плазмы М клетки среди энтероцитов, служит рецептором для transcytotic подмножество синантропных и патогенных энтеробактерий, в том числе кишечной палочки и сальмонеллы enterica серовар Typhimurium (S. Typhimurium ), признав FimH, компонента типа я пили на бактериальные наружной мембраны ^5. Здесь мы представляем метод применения патча мыши Пейера кишечного анализа цикла для оценки бактериальной поглощение клетками M. Этот метод является улучшенной версией мыши кишечная петля анализа описанных выше ^{6, 7.} Улучшение точек таковы: 1. Изофлюрана был использован в качестве анестетика. 2. Примерно в 1 см лигируют кишечного включая циклПатч ING Пейера была создана. 3. Бактерии рассмотрен клетки М были помечены флуоресцентно флуоресценции реагента маркировки или гиперэкспрессией флуоресцентного белка, такие как зеленый флуоресцентный белок (GFP). 4. М клеток фолликула связанных эпителия покрытие патч Пейера были обнаружены целые монтажа immunostainig с анти антитела GP2. 5. Флуоресцентные бактериальных трансцитоза клетками М наблюдались с помощью конфокальной микроскопического анализа. Патч мыши Пейера кишечного анализа цикла может дать ответ какую комменсальной или патогенных бактерий трансцитоз клетками М, и может привести нам понять молекулярный механизм, как стимулировать иммунную систему слизистой оболочки через ячейки M.

Protocol

1. Подготовка бактериальных клеток

1. Подряд глицерина заполненный люминесцентные бактерии (например, GFP выражения S. Typhimurium) на LB агар пластины, содержащей 100 мкг / мл ампициллина.
2. Культура одну колонию из LB агар на ночь в 2 мл новая среда LB.
3. Добавить 0,5 мл бактериальной культуры в 4,5 мл питательной среды LB и инкубировать до оптической плотности 1,0 при 600 нм достигается.
4. Урожай бактериальных клеток путем центрифугирования (3000 мкг, 5 мин, 4 ° С).
5. Удалите супернатант и мыть два раза с 5,0 мл стерильного фосфатного буфера физиологический раствор (PBS).
6. Ресуспендируют бактериальных гранул с 5 мл PBS, а также использовать 50 мкл суспензии, содержащей около 10 ⁷ колониеобразующих единицы (КОЕ) в качестве посевного.
7. В случае использования флуоресцентно меченных бактерии, бактериальные клетки были помечены флуоресценции реагента маркировки в соответствии со стандартом протокола.

2.nesthesia

1. Заполните небольшую пластиковую коробку (10 х 10 х 5 см) с 5% (объем / объем) испаряется изофлуран в смеси с воздухом (расход: 200 мл / мин).
2. Обезболить восьми до шестнадцати-слабых-летний мужчина или женщина мышей в поле.
3. Перемещение мышей вскрытии таблицы после наркоза.
4. Постоянно обезболить мышей на 2% (объем / объем) испаряется изофлуран в смеси с воздухом (расход: 200 мл / мин) (рис. 1). Это терминал процедуры.

3. Патч цикл лигируют Пейера анализа

1. Надрезать 1 см кожи живота, а затем сократить брюшной брюшины наркозом мыши и вывезти тонкой кишки содержащие патч Пейера.
2. Лигировать кишечника с мулине, пряжа, заботясь, чтобы избежать кровеносных сосудов. Примечание: только связываются с одной стороны кишечника, и оставить другой стороны свободно.
3. Inject 50 мкл бактериальной суспензии или PBS (контроль) с помощью шприца в патч цикл лигируют Пейера на свободе сязь кишечника (рис. 2).
4. Привязка свободную сторону, и закрыть живот мышки при клипа.
5. Через 1 ч, удалите лигируют патч цикл Пейера и эвтаназии мышь шейки дислокации.
6. Акцизный Пейера патч от патча цикл лигируют Пейера.
7. Мигает апикальной стороне патч Пейера по 1 мл PBS с использованием шприца придает иглу для удаления избытка слизистой жидкости и бактерий. Мигает патч Пейера еще два раза.

4. Всего окрашивания монтировать и конфокальной микроскопический анализ патч Пейера

1. Fix патч Пейера в Cytofix BD / Cytoperm решение на льду в течение 1 часа.
2. Вымойте патч Пейера три раза с 1 мл BD Пермь / промывочного буфера в течение 5 минут, а затем блок с 1 мл блокирующего буфера, содержащего 0,1% (вес / объем) сапонин, 0,2% (вес / объем) BSA в PBS в течение 30 мин на льда.
3. Добавить 200-кратного разбавленный антимышиным GP2 моноклональные антитела (5 мкг / мл), образец для обнаруженияМ клеток.
4. Выдержите в течение 2 часов при комнатной температуре или на ночь при 4 ° C.
5. Промыть три раза с 1 мл холодного PBS, затем добавить 200-кратного разбавленный анти-IgG-антител крысы сопряженных с DyLight549 (20 мкг / мл) для образца.
6. Инкубируйте образцы на льду в течение 2 часов.
7. Промыть три раза с 1 мл холодного PBS, затем добавить 50-кратное разбавленный Alexa 633 сопряженных фаллоидином к образцу для обнаружения F-актина.
8. Инкубируйте на льду в течение 2 часов.
9. Вымойте слегка с 1 мл холодного PBS. Затем поместите 3:57 образцах круглого остекления на слайде, и вставлять образцов в 30% раствор глицерина в PBS на слайде (рис. 3).
10. Соблюдайте образцов с DM-IRE2 конфокальной лазерной сканирующей микроскопии и деконволюции DeltaVision Восстановление микроскопом.

5. Представитель Результаты:

Образец пример мыши лигируют патч Пейера цикл анализа с GFP-брюшного тифаmurium наблюдалось при деконволюции DeltaVision Восстановление микроскопа (рис. 4). GFP-S. Typhimurium является трансцитоз по GP2 М ^{+ клеток.} Патч мыши Пейера кишечного анализа цикла может определить вид синантропных или патогенных бактерий, которые могут быть трансцитоз клетками M.

Рисунок 1. Анестезия мышей в испаряется изофлуран состоянии. Испаряясь изофлуран было поставлено анестезии посвященный аппарата (левая сторона).

Рисунок 2. Резюме патч лигируют Пейера кишечного анализа цикла. Флуоресцентные бактериальной суспензии вводили с помощью шприца в патч цикл лигируют Пейера на свободе стороны кишечника.

Рисунок 4. Пример мыши лигируют патч Пейера цикл анализа с GFP-S. Typhimurium. GP2, о котором сообщается, как M ячейки специфическим маркером ^5, окрашивали анти-мышиных антител GP2 (красный). Образце наблюдалось с деконволюции микроскопом DeltaVision реставрации. GFP-выражения S. Typhimurium был одним из локализованных с GP2 на апикальной мембране клеточной плазмы М и в субапикально цитоплазматических везикул (наконечники стрел). Top, апикально. Нижняя и боковые, боковые взгляды. Шкала бар: 10 мкм.

Discussion

Инкубационный период патча лигируют Пейера с бактериальной суспензии, как правило, в течение 1 часа наблюдать бактериальный включения в клетках M. В случае 4 часа инкубации, бактерии часто обнаруживаются в зоне Т-клеток патчей Пейера. Как испаряются изофлуран анестезии ингаляционными мог держать мышей стабильной, времени инкубации патч лигируют Пейера с бактериальной суспензии продолжается до наблюдать бактерии, которые перемещаются в Т-клеточной зоны в патче Пейера. Важным моментом этого эксперимента состоит, что...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер по каталогу	Комментарии (необязательно)
LB-агар Ампициллин 100	SIGMA	L5667
Cy3 моно-реактивного Dye обновления	GE Healthcare	PA23001
Alexa Fluor 350 карбоновые кислоты, сукцинимидил эфир	Invitrogen	A10168
Ингаляционный наркоз аппарат	Синано Seisakusho	SN-487
Фиксация и Пермеабилизации Решение	BD	554722
Антивирус мыши Гликопротеина 2 антитело	MBL	D278-3	200-кратного разбавления (5μg/ml)
Коза Anti-IgG крысы, Р (аЬ ') 2-фрагмент конкретный	Джексон ImmunoResearch	112-505-006	200-кратного разбавления (20μg/ml)
Alexa Fluor 633 Фаллоидином	Молекулярные зонды	A22284	50-кратное разбавление
Конфокальной лазерной растровый микроскоп	Leica Microsystems	DMIRE2
DeltaVision Восстановление деконволюция микроскоп	Прикладная Precision	Основные DeltaVision