Оптогенетическая индукция длительной депрессии для подавления наркостремящегося поведения у крыс

Аннотация

Источник: Rich, M. T., et al. Использование оптогенетики для обращения вспять нейропластичности и подавления поиска кокаина у крыс. J. Vis. Exp. (2021)

В этом видео демонстрируется использование оптогенетики для индуцирования долгосрочной депрессии (LTD) в синапсах медиального коленчатого ядра латерального миндалевидного тела (MGN-LA), ослабляя индуцированное сигналом поведение по поиску наркотиков в модели крысы. Крыса, которой хирургическим путем имплантированы оптические волокна и вирусно преобразована для экспрессии светочувствительных ионных каналов, подвергается оптогенетической стимуляции низкочастотными оптическими импульсами, вызывающими высвобождение нейромедиаторов и ослабление синапсов. Этот процесс снижает синаптическую передачу MGN-LA через интернализацию рецепторов нейротрансмиттеров, что в конечном итоге нарушает связь между сигналами и поведением при поиске наркотиков.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Внутривенная катетеризация грызунов, доставка вирусов и имплантация оптического волокна

1. Подготовьте животных к операции.
   1. Полностью обезболивайте крыс анестетиком по выбору в соответствии с рекомендациями учреждения. Одним из вариантов является кетамина гидрохлорид (87,5-100 мг/кг, внутримышечно [в/м]) и ксилазина гидрохлорид (5 мг/кг, в/м). Убедитесь, что крыса полностью обезболивается, проверив отсутствие рефлекса щипкового рефлекса на пальце ноги.
      ВНИМАНИЕ: Кетамин является контролируемым веществом, с которым необходимо обращаться в соответствии с рекомендациями учреждения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании используются внутримышечные инъекции анестетиков, поскольку они обеспечивают более быструю и надежную индукцию анестезии, чем внутрибрюшинная инъекция. Постоянно контролируйте дыхание и реакцию крысы и обеспечьте тепловую поддержку на протяжении всей операции.
   2. Выбрейте большую часть спины крысы (верхнюю часть спины от чуть выше лопаток до середины спины), а также область шеи под правой передней конечностью и кожу головы.
   3. Поместите крысу в операционную зону и нанесите на глаза puralube (искусственные слезы). Введите объем карпрофена (анальгетика) подкожно (подкожно [подкожно]) через кожу верхней части спины, затем введите 5 мл раствора лактата Рингера в.к. через кожу нижней части спины.
   4. Продезинфицируйте все хирургические участки, смочив кусок стерильной марли бетадином и протерев им выбритую операционную область круговыми движениями. Затем повторите процесс с 70% этанолом. Повторите этот чередующийся цикл три раза.
2. Выполняйте внутривенную имплантацию катетера в соответствии с ранее опубликованными протоколами.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Во время этой операции не используется хирургическая простыня, чтобы избежать раздражения во время имплантации катетера. Стерилизуйте все инструменты и оборудование перед использованием. Используйте стерильные перчатки и меняйте перчатки при контакте с нестерильной поверхностью.
3. Сразу после имплантации катетера закрепите крысу в стереотаксической раме для выполнения инъекций аденоассоциированного вируса (AAV).
   1. Введите подкожную (s.c.) инъекцию 2% лидокаина (0,2-0,3 мл) в кожу головы в качестве местного анестетика.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Местный анестетик не используется во время внутривенной имплантации катетера, чтобы избежать изменений в результатах операции.
   2. Подсоедините инъекционную канюлю из нержавеющей стали 26-го калибра к шприцу Hamilton, наполненному 1 мкл концентрированного раствора AAV: либо AAV5-hSyn-tdTomato, либо AAV5-hSyn-oChIEF-tdTomato
      ПРИМЕЧАНИЕ: oChIEF является вариантом чувствительного к синему свету опсин каналродопсина (ChR2), который может реагировать на широкий диапазон частот и, следовательно, имеет полезность для экспериментов по низкочастотной долгосрочной депрессии (LTD), обсуждаемых в этом протоколе, но также и для экспериментов по высокочастотному долгосрочному потенцированию (LTP). Конструкция oChIEF была подарена доктором Роджером Тсьеном и обработана для упаковки и очистки ядром вирусного вектора Duke. Между днем инъекции и днем индукции LTD требуется не менее 3-4 недель, чтобы обеспечить оптимальную экспрессию вируса в медиальном коленчатом ядре аксонных окончаний таламуса (MGN).
      ВНИМАНИЕ: Как правило, AAV рассматривается как организм уровня биобезопасности 1 (BSL-1) с низким риском самозаражения, если при его производстве не используется вирус-помощник. Для его использования требуется одобрение Институционального комитета по уходу за животными и их использованию (IACUC), а надлежащие средства индивидуальной защиты (СИЗ) должны использоваться постоянно в соответствии с институциональными рекомендациями по ограничению ненужного воздействия.
   3. С помощью скальпеля сделайте разрез 0,5 мм от передней до задней части черепа и удалите вышележащие ткани, чтобы обнажить поверхность черепа.
   4. Выровняйте голову крысы по передней/задней оси и обнулите стереотаксические координаты до брегмы.
   5. Просверлите три небольших отверстия в черепе с помощью инструмента Dremel, оснащенного небольшим сверлом. Используйте отвертку для надежного крепления винтов из нержавеющей стали (M2x4 965-A2) на место.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Винты необходимы для правильного прилегания стоматологического цемента и создания прочных, долговечных колпачков. Положение винтов должно быть распределено по передне-задней оси черепа и в сторону от места инъекции AAV.
   6. Просверлите двусторонние отверстия для инъекции AAV на основе координат из Атласа мозга крысы (Watson and Paxinos) для медиальной части медиального коленчатого ядра (MGN); в мм от bregma, переднезадний (AP): -5,4; медиолатеральный (ML): ±3,0; дорсовентральный (DV): -6,6. Медленно опускайте канюли для инъекций (4 мм/мин) до тех пор, пока они не будут установлены в MGN. Вводите концентрированный раствор AAV со скоростью 0,1 мкл/мин.
   7. Оставьте канюлю для инъекций на месте на 5 минут после завершения инфузий, чтобы обеспечить диффузию от канюли, а затем медленно извлеките канюлю из мозга.
4. Сразу после инъекции вируса продолжайте имплантацию оптических волокон, нацеленных на терминалы MGN-LA.
   1. Используйте инструмент Dremel для сверления двусторонних отверстий для имплантатов оптического волокна, нацеленных на латеральную миндалевидное тело (в мм от брегмы, AP: -3.0; ML ±5.1).
   2. С помощью щипцов захватите наконечник оптоволоконного имплантата и закрепите его на стереотаксических адаптерах, чтобы они надежно удерживались на месте.
   3. Медленно опускайте волокна со скоростью 2 мм/мин, пока кончик волокна не окажется в дорсальной части LA (дорсовентральное [DV]: -7,9 мм).
   4. Сначала закрепите наконечники на черепе с помощью тонкого слоя мгновенного клея Loctite, затем стоматологического цемента, а затем накройте наконечники рукавами диаметром 1,25 мм и пылезащитными чехлами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор клея для крепления наконечников к черепу должен быть одобрен местным или институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию. Для этого исследования используется локтит для надежного крепления наконечников к черепу после проб и ошибок с помощью нескольких клеев; Тем не менее, можно рассмотреть доступные альтернативы.
5. После хирургических процедур содержат крыс индивидуально и обеспечивают свободный доступ к пище и воде. Обеспечьте послеоперационный уход в соответствии с рекомендациями учреждения. Ежедневно промывайте катетеры физиологическим раствором, содержащим гентамицин (5 мг/мл) и гепарин (30 USP/мл) для поддержания проходимости. По крайней мере, через 5 дней после операции и за 24 часа до начала поведенческих экспериментов ограничивайте крыс в пище до ~90% от их свободного веса.

2. Самостоятельное введение кокаина грызунами и аппаратное потушение рычага

ПРИМЕЧАНИЕ: Все поведенческие процедуры проводятся в стандартных камерах оперантного кондиционирования, оснащенных двумя выдвижными рычагами на одной стене, стимульным светом над каждым рычагом, тональным генератором, домашним светом и инфузионным насосом.

1. Подвергайте крыс ежедневным 1-часовым сеансам самостоятельного приема кокаина (2 мг/мл) по графику подкрепления с фиксированным соотношением 1 (FR1).
   1. Помещайте крыс в оперантную камеру каждый день и позволяйте крысам нажимать на рычаги. Нажатие на обозначенный «активный рычаг» (уравновешенный между левым и правым рычагами) приводит к вливанию кокаина (1,0 мг/кг/инфузия) и представлению сложного светового и тонального сигнала в течение 10 секунд. Нажатие на обозначенный «неактивный рычаг» не имеет запрограммированных эффектов.
   2. Продолжайте эксперименты по самостоятельному введению в течение как минимум 10 дней до тех пор, пока крысы не получат не менее 8 инфузий в день в течение 3 дней подряд. Недостижение критериев приобретения к 20-му дню приводит к исключению из исследования.
2. После успешного выполнения критериев захвата, подвергните крыс 1 часу сеансов инструментального вымирания в течение 6-10 дней.
   1. Поместите крыс в оперантные камеры и позвольте крысам свободно нажимать на кнопки. Тем не менее, реакции как на активные, так и на неактивные рычаги не имеют запрограммированных последствий.
   2. Пусть крысы продолжают инструментальное вымирание ежедневно, пока не произойдет в среднем < 25 нажатий на рычаг в течение двух дней подряд.

3. Оптогенетическая индукция in vivo

ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперименты по оптогенетическому ингибированию проводятся через 24 часа после последнего дня инструментального угасания.

1. Подключите патч-корды к синему лазерному диоду с длиной волны 473 нм через вращающееся соединение, подвешенное над чистой, стандартной клеткой для содержания грызунов со снятой крышкой. Такая установка позволяет грызунам свободно перемещаться по клетке во время оптогенетической стимуляции.
2. Включите лазерный диод согласно инструкции по эксплуатации и подключите к генератору импульсов. Отрегулируйте настройки таким образом, чтобы при включении крыса получала 900 импульсов света продолжительностью 2 мс с частотой 1 Гц.
   ВНИМАНИЕ: Во время работы с лазером необходимо постоянно использовать надлежащую защиту глаз.
3. Измерьте интенсивность света через патч-корд с помощью датчика освещенности. Отрегулируйте интенсивность лазера так, чтобы световой поток через патч-кабель составлял ~5-7 мВт.
4. Поместите крыс в чистую вольерку. Снимите пылезащитные чехлы и втулки с наконечниками, обнажив наконечники. Подсоедините патч-корды с обеих сторон к имплантатам оптического волокна. Дайте крысам исследовать окружающую среду в течение 3 минут до введения LTD.
5. Включите генератор импульсов, чтобы начать оптогенетическую стимуляцию.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя это маловероятно, если у крыс возникают какие-либо побочные реакции на стимуляцию, эксперимент немедленно прекращается, и крысы должным образом усыпляются в соответствии с рекомендациями учреждения.
6. После введения ППТ крыс подержите в клетке в течение 3 минут, а затем верните их обратно в домашние клетки.
7. Для контрольных экспериментов используйте ту же процедуру стимуляции на крысах, которые экспрессируют контрольный вирус AAV5-tdTomato. Для фиктивных экспериментов прикрепите патч-корд к оптическому волокну крыс, экспрессирующих вирус AAV5-oChIEF, но стимуляция не будет произведена в течение 15-минутного сеанса.

4. Проверьте влияние оптогенетической стимуляции на индуцированный кокаином, ищущий кокаин<

ol style='list-style-type:decimal;'>

через 24 часа после оптогенетической стимуляции in vivo, поместите крыс обратно в камеры оперантного обусловливания. Крысы подвергаются 1-часовому стандартному сеансу восстановления, вызванному сигналом, для оценки поведения при поиске кокаина.
ПРИМЕЧАНИЕ: Во время восстановления, вызванного сигналом, реакция на активном рычаге дает 10-секундное представление сигнала, связанного с кокаином, но без вливания кокаина.

Проведите второй тест на восстановление не менее чем через 1 неделю после первого теста, чтобы определить, приводит ли оптогенетическая индукция LTD к долгосрочному подавлению поиска кокаина.

Материалы