Индуцирование повреждения малоберцового нерва у мышей для изучения регенерации нервно-мышечного перехода

Аннотация

Источник: Dalkin, W., et al. Метод повреждения малоберцового нерва: надежный анализ для выявления и тестирования факторов, восстанавливающих нервно-мышечные соединения. J. Vis. Exp. (2016)

В этом видео показана хирургическая процедура индуцирования повреждения малоберцового нерва у мыши для изучения регенерации нервно-мышечного соединения (NMJ). Процедура включает в себя обнажение малоберцового нерва, применение контролируемого давления для индуцирования травмы и обеспечение того, чтобы эпиневрий оставался неповрежденным для поддержки регенерации аксонов. Со временем макрофаги очищают аксональный мусор, способствуя восстановлению нервов и восстановлению NMJ.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Подготовка животных к хирургическому вмешательству:

1. обезболить мышей смесью кетамина (90 мг/кг) и ксилазина (10 мг/кг) путем подкожного подкожного впрыскивания с помощью стерильного инсулинового шприца объемом 1 мл. Раствор-носитель содержит смесь 0,9% физиологического раствора, 17,4 мг/мл кетамина и 2,6 мг/мл ксилазина. Поместите животных обратно в клетки в ожидании начала действия лекарства.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если нагрузочная доза не обеспечивает достаточную анестезию на протяжении всей процедуры, можно ввести дополнительные 25% от нагрузочной дозы.
2. Наблюдайте за животными после инъекции, чтобы проверить устойчивую частоту дыхания и соответствующее снижение уровня возбуждения. Проверьте уровень возбуждения, ущипнув заднюю лапу, которая не должна вызывать никакой реакции при достаточной анестезии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно это занимает 3-5 минут для молодой взрослой мыши в среднем от 25 до 30 г. Если животное все еще реагирует на терапию через 10 минут после инъекции, можно ввести дополнительные 25% от дозы анестетической нагрузки.
3. Нанесите вазелина и легкое минеральное масло офтальмологической мази на глаза животного для профилактики сухости. Выньте животных из клетки и поместите их на чистую ровную поверхность. Оббрейте желаемую заднюю конечность от стопы до таза с помощью электрического триммера для волос, обнажая только боковую сторону конечности.
4. Нанесите химическое средство для удаления волос на выбритый участок на 1 мин. Вручную удалите волосы с помощью лабораторных салфеток. Очистите депиляционный участок с помощью лабораторной салфетки, смоченной в этаноле.

2. Хирургическая процедура

1. : Стерилизуйте хирургические инструменты с помощью автоклава или другим подходящим методом. Очистите место операции и операционную доску 80% этанолом/H₂O. Продезинфицируйте место операции провидоном. Поместите мышь на операционную доску и совместите ее с ограничителями конечностей. Удерживайте целевую заднюю конечность в анатомически естественном положении, слегка вытянув коленный сустав без внутреннего или внешнего вращения.
2. Поместите животное и посадите его под хирургический микроскоп. Ориентируйтесь на правильное место разреза с помощью пальпации поверхностных ориентиров, в частности костного коленного сустава и гребня между передней большеберцовой и икроножной мышцами.
3. Сделайте разрез примерно на 3 см через кожу с помощью скальпеля или пружинных ножниц, используя при этом общие щипцы для захвата. Сделайте разрез перпендикулярно основному руслу общего малоберцового нерва.
4. Продолжайте разрез через поверхностную фасцию, обнажая двуглавую мышцу бедра и латеральную широту. Разделите эти мышцы, разрезав соединительную глубокую фасцию. Надреза на 1-2 см должно быть достаточно.
5. Втяните двуглавую мышцу бедра каудально с помощью механических ретракторов, обнажая общий малоберцовый нерв.
6. Проведите по нерву проксимально до тех пор, пока не будет обнаружено его пересечение с сухожилием латеральной головки икроножной мышцы.
   Примечание: Воздействие может потребовать дополнительных манипуляций с втянутой кожей и мышцей. Этот перекресток используется как устойчивый ориентир для повреждения нерва.
7. Захватите нерв тонкими щипцами, выровняв кончики параллельно боковой границе сухожилия икроножной мышцы. Раздавите общий малоберцовый нерв, оказывая постоянное сильное давление в течение 5 секунд.
8. Подтвердите полное раздавливание нерва путем визуального осмотра через хирургический эндоскоп. На месте травмы он будет казаться полупрозрачным. При использовании мышей, экспрессирующих флуоресцентные белки в периферических аксонах, флуоресценция исчезнет из места повреждения.
9. Удалите ретракторы и выровняйте мышцы в их анатомическом положении. Закройте место разреза шелковыми швами 6-0. Достаточно 1-3 простых прерывистых швов. Поместите восстанавливающуюся мышь на грелку в чистую клетку.
10. Наблюдайте за всеми животными в течение 2 часов после операции, чтобы проверить дыхание и любые побочные реакции на анестезию. Вводите начальную дозу бупренорфина в дозе 0,05-0,10 мг/кг через подкожную паховую инъекцию сразу после восстановления после операции. Вводите 3 дополнительные дозы каждые 12 часов в течение следующих 48 часов. После полного выздоровления верните мышей в учреждение по уходу за животными.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Ketamine	VetOne	501072
Xylazine	Lloyd Inc.	3437
Бупренорфин	Zoopharm	1Z-73000-150910
Наир	Наир
Ким-салфетки	Kimtech	34155
Электрическая бритва	Braintree Scientific	CLP-64800
80% EtOH/H₂O
10% провйод
1 мл инсулиновый шприц
пружинные ножницы	Vannas	91500-09
No15 скальпель	Braintree Scientific	SSS 15
#5 щипцы	Dumont	11252-00
6-0 шелковый шов на обратной режущей игле	Suture Express	752B
Грелка для грызунов	Braintree Scientific	AP-R-18.5
Alexa 555 Конъюгированные альфа-BTX	Молекулярные зонды	B35451
Vectashield	Vector Labs	H-1000
Olympus Стерео Зум Микроскоп	Olympus	562037192
Zeiss 700 Конфокальный микроскоп	Zeiss
Перистальтический перфузионный насос с переменным расходом	Fisher Scientific	13-876-3