Выполнение пользовательских Эксперименты Microarray микроРНК

Summary

Простая процедура выполнения пользовательских экспериментов микрочипов микроРНК описывается. Шаги включают в себя выделения РНК, РНК и маркировки ссылкой ДНК гибридизации образцы микрочипов, сканирования микрочипов, количественной оценки и анализа гибридизации сигналов.

Abstract

микроРНК (миРНК) являются большой семье ~ 22 нуклеотидов (нт) длинные молекулы РНК, которые широко выражено у эукариот ^1. Комплекс генома кодируют по меньшей мере сотни микроРНК, которые в первую очередь ингибирует экспрессию большого числа генов-мишеней после транскрипционно ^{2, 3.} микроРНК контроль широкий спектр биологических процессов ^1. Кроме того, изменения выражения микроРНК была связана с человеческими болезнями, такими как рак, и микро-РНК могут служить в качестве биомаркеров заболеваний и прогноз ^{4, 5.} Важно, таким образом, чтобы понять выражения и функции микроРНК под различными условиями.

Три основные подходы были использованы в профиль микроРНК выражение: ПЦР в реальном времени, микрочипов, и глубокие секвенирования. Техника микроРНК микрочипов имеет преимущество в том, высокую пропускную способность, как правило, менее дорогие, и большинство экспериментальных и анализ шаги могут быть Каррсамодельное взрывное устройство в лаборатории молекулярной биологии в большинстве университетов, медицинских школ и связанные с ними больницы. Здесь мы опишем метод для выполнения пользовательских экспериментов микрочипов микроРНК. Набор микроРНК зонд будет напечатан на предметные стекла для производства микрочипов микроРНК. РНК выделяли с использованием метода или реагент, который сохраняет мелкие виды РНК, а затем помечены флуоресцентным красителем. В качестве контроля ссылкой ДНК олигонуклеотидов соответствующее подмножество микроРНК также помечены различными флуоресценции красителя. Ссылка ДНК будет служить, чтобы продемонстрировать качество слайдов и гибридизации, а также будут использованы для нормализации данных. РНК и ДНК смешивают и гибридизации с микрочипов слайд, содержащий зонды для большинства из микроРНК в базе данных. После мытья слайд сканируется для получения изображения, и интенсивности отдельных пятен количественно. Эти сигналы сырья будут дополнительно обработаны и проанализированы как выражение данные соответствующего микроРНК. МкАrray слайды могут быть удалены и регенерируется снизить стоимость микрочипов и повысить согласованность микрочипов экспериментов. Те же самые принципы и процедуры применимы к другим типам пользовательских экспериментов микрочипов.

Protocol

1. Печать пользовательских микрочипов микроРНК

1. Печать микрочипов слайды использованием микрочипов основные услуги объекте в университете или компании. Качество изготовления микрочипов является одним из важнейших факторов для успеха эксперимента микрочипов. Попробуйте несколько услуг, если это возможно. В идеале следовало бы напечатать 50-100 слайдов за раз, и все слайды будут выглядеть одинаково, с хорошо разделены, отдельные пятна.
2. Для поддержки микрочипов, мы используем ПРОБЕЛЫ II покрытием слайды.
3. Для микроРНК зондов, мы используем NCode нескольких видов микроРНК Microarray Зонд Установить V2.
4. Растворите все олигонуклеотидо....

Discussion

Несмотря на последние достижения в области технологий глубокой последовательности, микрочипов остается жизнеспособным выбором для высокопроизводительного анализа ДНК и РНК. По сравнению с глубоким последовательности, микрочипов эксперименты дешевле, а типичные лаборатории молекулярной биологии могут выполнять большинство экспериментов и анализа данных в доме, который обеспечивает гибкость и экономит время. В будущем, микрочипы, вероятно, хорошо подходит для интенсивно допрашивать набора генов, например, все или часть фа.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Элементы	Продавец	Номер по каталогу	Комментарии
NCode нескольких видов микроРНК Microarray Зонд Установить V2	Invitrogen	MIRMPS201	Разработанный на основе miRBase выпуска 9.0 (октябрь 2006). Он содержит ~ 1140 без изменений, 34-44 нт долго олигонуклеотидов в качестве зондов для червя, летать, данио, мыши, крысы и человека микро-РНК, и ряд внутренних зондов контроля, таких как snoRNAs. МикроРНК зонды дублетов последовательности дополняют зрелые микроРНК, следовательно, размер ~ 44 NT. Для анализа можно сосредоточиться на микроРНК от конкретного генома (ов), представляющих интерес.
Trizol	Invitrogen	15596018	Мы также использовали обогащается, небольшая часть РНК для маркировки, хотя общая образцов РНК быстрее и проще в приготовлении и количественно и подходит для последующих приложений, таких как мРНК анализа.
Т4 РНК-лигазы 1	Новая Англия Biolабс	M0204L
Ulysis Alexa Fluor 647 нуклеиновых кислот Kit маркировки	Invitrogen	U21660	Этот комплект или аналогичные продукты могут быть использованы для обозначения экспериментальных образцов РНК или РНК контроля (вместо контроля ДНК), а также.
5'-PCU-DY547-3 '	Dharmacon	На заказ	Мелкая фракция РНК может быть так же помечены труб.
CentriSep столбцов	Принстон Цветоделение	CS-901
GAPSII покрытием слайдов	Гранулирование	40004	Другие типы слайды могут быть использованы.
Камеры Microarray гибридизации	Гранулирование	2551 или 40080	Другие виды гибридизации камер и покровные также должны работать. Использование имеющихся в продаже машин гибридизация может уменьшить гибридизации время существенно, например, до ~ 2 часа.
Lifterslips	ThErmo / Эри Научные	25X60I-M5439-001-LS
BlueFuse	BlueGenome
GeneSpring	Agilent