Разработка микротканеинженерной нейронной сети с использованием микроколонки на основе гидрогеля

Аннотация

Источник: Струзина, Л. А. и др., Анатомически вдохновленные трехмерные микротканевые нейронные сети для реконструкции, модуляции и моделирования нервной системы. J. Vis. Exp. (2017)

В этом видео демонстрируется разработка микротканеинженерных нейронных сетей с использованием гидрогелевой микроколонки с ядром внеклеточного матрикса. Засеянные нейронные агрегаты прилипают, расширяют проекции и формируют структурированные нейронные сети, способствуя прогрессу в нейроразвитии и нейротерапевтических исследованиях.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Разработка агарозного гидрогеля (Бесклеточный компонент микротканевых нейронных сетей (микро-ТЭНов))

1. Приготовление раствора агарозы
   1. В шкафу биобезопасности подготовьте резервуары для микроколонн, передав по 20 мл фосфатно-солевого буфера Дульбекко (DPBS) в каждую из двух 10-сантиметровых чашек Петри. Тонкие щипцы и микроскальпели простерилизовать с помощью стерилизатора с горячими шариками.
   2. Взвесьте 3 г агарозы и переложите ее в стерильный стакан внутри шкафа биобезопасности. Добавьте 100 мл DPBS для получения конечной концентрации 3% вес/объем (w/v). Включите в комплект чистую магнитную планку и накройте стакан алюминиевой фольгой.
   3. С помощью горячей плиты/мешалки нагрейте стакан до 100 °C и перемешайте со скоростью 120-200 об/мин, чтобы полностью растворить агарозу (раствор превратится из мутного в прозрачный). Продолжайте нагревать и перемешивать после этого, чтобы предотвратить гелеобразование, и при необходимости изменяйте температуру нагрева, чтобы избежать пригорания агарозы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Изготовление с помощью устройства лазерной резки и капиллярных трубок представлено ниже в подразделах 1.2 и 1.3 соответственно. Перейдите к подразделу 1.4 после выполнения действий, описанных в любом из подразделов. Для обоих методов изготовления микроколонн добавьте жидкую агарозу быстро, так как агароза быстро затвердевает при охлаждении. При стерилизации автоклавом на любом из следующих этапов используйте стандартные условия, применяемые к стеклянной посуде.
2. Подготовка микроколонн с помощью устройства для лазерной резки
   ПРИМЕЧАНИЕ: Устройство для лазерной резки вырезается из прозрачного акрила с помощью коммерческого лазерного резака CO₂. Изготовление конструкций и устройств с помощью лазерной резки хорошо задокументировано для целого ряда инженерных и исследовательских применений. Эта форма (рис. 1) состоит из массива из пяти цилиндрических каналов, каждый диаметром 398 мкм и длиной 6,35 мм. Эти цилиндрические массивы образованы по длине двумя частями: нижней половиной (длина: 25,4 мм, ширина: 6,35 мм, высота: 6,0 мм) и верхней половиной (длина: 31,5 мм, ширина: 6,35 мм, высота: 12,7 мм), как показано на рисунках 1А и 1В соответственно. Две половинки могут быть зажаты вместе передним и задним колпачками, показанными на рисунке 1C (длина: 31,5 мм, ширина: 6,35 мм, высота: 12,7 мм), которые имеют четыре выравнивающих отверстия, которые совпадают с двумя отверстиями на верхней и нижней частях и помогают закрепить все детали вместе при завинчивании. Эти колпачки также включают в себя пять отверстий, концентрических по отношению к цилиндрическим каналам, в которые могут быть вставлены акупунктурные иглы для формирования просвета микроколонок.
   1. Простерилизуйте устройство, показанное на рисунке 1, накрыв его алюминиевой фольгой и автоклавирование. Соберите устройство, как показано на рисунке 1D, совместив переднюю и заднюю крышки только с нижней половиной части и закрепив три части двумя винтами #4-40 и гайками (диаметр резьбы: 3,05 мм) в нижних юстировочных отверстиях.
   2. Полностью введите акупунктурную иглу (диаметр: 180 мкм, длина: 30 мм) в отверстия иглы на переднем или заднем колпачке устройства (рис. 1D). С помощью микропипетки налейте достаточное количество жидкой агарозы (~1 мл для пяти каналов) на нижнюю половинку, чтобы полностью заполнить каждую из половинок цилиндрических каналов.
   3. Немедленно поместите верхнюю половину устройства над нижней половиной и надавите на нее, пока она не станет прочно на месте, чтобы завершить цилиндрические каналы (трение между колпачками и верхней частью будет удерживать последнюю на месте). Подождите ~5 минут при комнатной температуре после добавления агарозы, чтобы она успела образоваться внутри каналов устройства.
   4. Вручную извлеките иглу из каждого из отверстий на колпачках устройства. Открутите винты и вручную отделите две крышки и верхнюю половину от нижней половины, где последняя будет удерживать гидрогелевые микроколонки.
   5. С помощью тонких щипцов аккуратно удалите микростолбики из каналов на нижней половине куска и поместите их в заранее подготовленную чашку Петри, содержащую DPBS (шаг 1.1.1). Повторно используйте устройство для еще одного раунда изготовления микроколонок. Перейдите к подразделу 1.4.
3. Изготовление микроколонн с использованием капиллярных трубок
   1. Перенесите стеклянные капиллярные трубки (диаметр: 398,78 мкм, длина: 32 мм) внутрь шкафа биобезопасности. Вручную разломите длинные трубки на фрагменты по 2,0–2,5 см и полностью введите в каждый фрагмент по одной акупунктурной игле (диаметр: 180 мкм, длина: 30 мм) (рис. 2А).
   2. Перелейте 1 мл жидкой агарозы из стакана на поверхность пустой чашки Петри. Удерживая капиллярную трубку и введенную иглу, поместите один конец трубки в контакт с жидкой агарозной лужей, чтобы заполнить ее капиллярным действием. Взбалтывайте трубку, чтобы стимулировать подъем капилляров.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Заполните капиллярные трубки жидкой агарозой настолько, насколько позволяет капиллярное действие; После этого эти микроколонны могут быть разрезаны на более мелкие конструкции в зависимости от желаемой длины. Агарозный бассейн объемом 1 мл обычно используется только для одной трубки, поскольку агароза быстро охлаждается и гелеобразно, предотвращая дальнейшее действие капилляров.
   3. Когда жидкость перестанет подниматься, извлеките капиллярную трубку из бассейна и поместите ее горизонтально на поверхность чашки Петри. Подождите 5 минут, чтобы агарозный гель остыл внутри тюбиков.
   4. Расположите большой и указательный пальцы по обе стороны трубки и прижмите к ней. Другой рукой быстро вытащите иглу, в то время как большим и указательным пальцами предотвратите соскальзывание микроколонки из трубки. Вставьте иглу 30-го калибра в капиллярную трубку, чтобы медленно вытолкнуть микроколонку в чашку, содержащую DPBS (шаг 1.1.1).
4. Обрезка и стерилизация микроколонок
   1. Аккуратно перенесите одну микроколонку из DPBS в пустую тарелку с помощью тонких щипцов. Добавьте 10 μL DBPS в верхнюю часть микроколонки с помощью микропипетки, чтобы предотвратить высыхание. Поместите последнюю чашку под стереоскоп для визуального контроля.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На протяжении всего протокола сушка или обезвоживание в микроколонках относится к приобретению смятой структуры, которая визуально отличима от типичного гидратированного вида этих конструкций. Обезвоженные микроколонны прочно прикрепляются к поверхности чашек Петри и не могут быть легко перемещены, в то время как гидратированные конструкции имеют тенденцию скользить по поверхности после манипуляций с помощью щипцов. Фазово-контрастное изображение полностью высушенной микроколонки показано на рисунке 3А.
   2. Обрежьте микростолбик микроскальпелем, чтобы укоротить его до нужной длины (в данном случае 2-5 мм). Транспортируйте обрезанную микроколонку с помощью тонких щипцов в другую чашку Петри DPBS, подготовленную на шаге 1.1.1.
   3. Повторите шаги 1.4.1 и 1.4.2 для каждой изготовленной микроколонны.
   4. Стерилизуйте микроколонки в чашках Петри, содержащих DPBS, под ультрафиолетовым (УФ) светом в течение 1 ч. Храните чашки Петри при температуре 4 °C перед добавлением внеклеточного матрикса (ВКМ) и нанесением клеточного покрытия.

2. Первичная культура нейронов и метод принудительной агрегации

1. клеток Подготовка пирамидального массива микролунок
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе используется напечатанная на 3D-принтере форма, состоящая из цилиндрического основания (диаметр: 2,2 см, высота: 7,0 мм) и девяти квадратных пирамид сверху (длина стороны: 4,0 мм, угол наклона: 60°), организованных в массив 3 x 3, как показано на рисунке 1E. Процесс аддитивного производства с использованием коммерчески доступных 3D-принтеров хорошо задокументирован. Для проектирования пресс-формы может быть использовано программное обеспечение для автоматизированного проектирования. Полученный файл проекта затем может быть преобразован в цифровую траекторию для 3D-принтера. Каждый принтер имеет разные технические характеристики, и инструкции по настройке и эксплуатации 3D-принтера различаются соответственно.
   1. Используйте сверло 3/32" для прокола 16 отверстий в массиве 4 x 4 (длина стороны: 4 см, расстояние между отверстиями: 1 см), центрированных в крышке чашки Петри 10 см. Внутри вытяжного шкафа для химикатов используйте нижнюю часть чашки Петри, чтобы взвесить 27 г полидиметилсилоксана (PDMS) и 3 г отвердителя (в соотношении 1:10). Перемешайте микрошпателем, чтобы средство распределилось равномерно.
   2. Накройте PDMS/отвердитель проколотой крышкой. Подсоедините один конец шланга к вакуумному отверстию вытяжного шкафа, а другой конец вставьте в шток воронки (диаметр горловины: 10 см, длина штока: 3 см, диаметр штока: 1,5 см).
   3. Сделайте отверстие с помощью сверла 3/32 дюйма в верхней части колбы для дозатора объемом 1 мл, вставьте и закрепите наконечник микропипетки объемом 1 000 мкл в отверстие (заостренным концом вверх). Поместите колбу и наконечник в шланг и потяните шланг вверх, пока лампа не запечатает шланг в стебле воронки.
   4. Поместите воронку на проколотую крышку посуды и закрепите шланг имеющейся прочной опорой. Откройте вакуумный клапан на 5 минут для всасывания и выведите пузырьки воздуха на поверхность.
   5. Закройте клапан, снимите воронку и ударьте чашкой Петри о поверхность вытяжного шкафа ~3 раза, чтобы лопнуть оставшиеся пузырьки воздуха.
   6. Поместите напечатанную на 3D-принтере пирамидальную лунку в каждую из лунок в 12-луночной культуральной пластине пирамидами вверх. Залейте PDMS/отвердитель поверх форм до тех пор, пока все лунки пластины не будут заполнены. Накройте 12-луночную пластину крышкой и переведите в духовку на 1 час при температуре 60 °C для сушки.
   7. Осторожно удалите каждую микролуночную решетку PDMS (рис. 1F) с планшета с помощью микрошпателя. Накройте массивы PDMS алюминиевой фольгой и простерилизуйте их путем автоклавирования. Внутри шкафа биобезопасности вставьте по одной микролунке в каждую лунку 12-луночного планшета (рис. 2B).
2. Выделение корковых нейронов из плодов крыс<ol style='list-style-type:decimal;'>
3. Добавьте ~20 мл сбалансированного солевого раствора Хэнка (HBSS) в каждую из четырех-шести 10-сантиметровых чашек Петри (по одной на каждую препарированную ткань) внутри шкафа биобезопасности. Переложите эту посуду в капюшон и поставьте на лед. Стерилизуйте инструменты для препарирования, такие как микроскальпели, ножницы и щипцы, с помощью стерилизатора с горячими шариками.
4. Предварительно разогрейте базальную среду эмбрионального нейрона + 2% бессывороточную добавку + 0,4 мМ L-глутамин (далее именуемый «питательная среда») и 0,25% трипсин + 1 мМ этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА) при 37 °C. Разморозьте дезоксирибонуклеазу (ДНКазу) I, поместив ее при комнатной температуре. Приготовьте 1,5 мл 0,15 мг/мл раствора ДНКазы I в HBSS и держите раствор на льду.
5. Усыпьте беременную крысу с эмбриональным периодом на 18-й день путем вдыхания углекислого газа и подтвердите смерть от обезглавливания. Переложите тушу в стерильный капюшон для вскрытия и положите его брюшной стороной вверх. Тщательно промойте брюшную полость 70% этанолом.
6. Вскрыть матку и извлечь плод (обычно ~11) из амниотических мешочков с помощью ножниц и перенести их с помощью щипцов в чашку Петри, содержащую холодный HBSS, как описано. Поместите охлажденный (-20 °C) гранитный блок под стереоскоп. Поместите чашку Петри на поверхность этого холодного блока, чтобы сохранить низкую температуру HBSS на протяжении всей процедуры препарирования.
7. Промойте детенышей, прополоскав HBSS, а затем переложите их в следующую чистую миску, содержащую HBSS. С помощью стереоскопа и инструментов для вскрытия последовательно удаляйте головки, полушария головного мозга и кору головного мозга плода и переносите каждую ткань с помощью щипцов в новую чашку, наполненную HBSS, после каждого вскрытия.
8. Аспирируйте только кору головного мозга с помощью пипетки Пастера и поместите ткань в стерильную центрифужную пробирку объемом 15 мл. Выбросьте остальные рассеченные ткани. Промойте кору головного мозга три раза, последовательно добавляя и удаляя ~5 мл HBSS с помощью серологической пипетки. Положите трубку на лед, когда она не используется.
9. Перенесите кору головного мозга с помощью пастеровской пипетки в пробирку объемом 15 мл, содержащую предварительно подогретый трипсин-ЭДТА (4-6 коры на 5 мл трипсина-ЭДТА). Вручную перемешайте пробирку один раз и поместите ее при температуре 37 °C. Переворачивайте пробирку каждые 3 минуты, чтобы предотвратить слипание ткани.
10. Прекратите воздействие трипсина через ~10 минут, удалив ткань с помощью пипетки Пастера и перенеся ее в чистую центрифужную пробирку объемом 15 мл. Добавьте 0,15 мг/мл раствора ДНКазы I (1,5 мл) в пробирку с помощью пипетки.
11. С помощью пастеровской пипетки вручную разбивайте комки ткани, а затем делайте вихрь (~30 с) до тех пор, пока раствор не станет однородным и в жидкости не останется фрагментов ткани. Если нет возможности полностью гомогенизировать раствор, извлеките нерастворимые фрагменты, втянув их в кончик пастеровской пипетки.
12. Центрифугируйте однородный клеточный раствор, полученный на шаге 2.2.9, при концентрации 200 x g в течение 3 мин. Удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки Пастера, стараясь не повредить гранулированные клетки. Добавьте 2 мл питательной среды с помощью серологической пипетки и вортекса для ресуспендирования клеток.
13. Подсчитайте количество клеток в растворе, приготовленном на шаге 2.2.10, с помощью гемоцитометра; ожидаемый выход составляет 3,0-5,0 х 10⁶ клеток/корковое полушарие. Приготовьте 1 мл или более клеточной суспензии в культуральной среде, плотностью 1,0-2,0 х 10⁶ клеток/мл.

Формирование агрегатов нейрональных клеток

1. С помощью микропипетки добавьте 12 μL клеточной суспензии 1,0-2,0 x 10⁶/мл в каждую микролунку матрицы PDMS (которая была помещена в планшет на шаге 2.1.7).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрацию клеток можно регулировать в зависимости от внутреннего диаметра микроколонки и желаемого размера клеточного агрегата, При более высоких концентрациях образуются более крупные агрегаты.
2. Центрифугируйте планшет при давлении 200 x g в течение 5 минут, чтобы вызвать агрегацию ячеек на дне микролунок (рис. 2B). Осторожно добавьте ~2 мл питательной среды в верхнюю часть каждой матрицы PDMS, чтобы покрыть все засеянные микролунки, стараясь не повредить агрегированные клетки.
3. Инкубируйте планшет в течение 12-24 часов при 37 °C и 5%_CO2.

3. Разработка клеточного компонента микро-TENNs

1. ECM core fabrication
   1. После инкубации агрегата добавьте коллаген и ламинин типа I в питательную среду (для концентрации 1 мг/мл каждая) в микроцентрифужной пробирке для приготовления раствора ECM. Выполните шаги 3.1.2-3.1.4 при комнатной температуре, но держите пробирку с ECM на льду, когда она не используется, чтобы предотвратить преждевременное гелеобразование.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Типичный расход составляет 4 μL раствора ECM на каждую микроколонку (длина: 5 мм, внутренний диаметр: 180 μм).
   2. Отрегулируйте pH раствора ECM, перенеся 1-2 μL на лакмусовую бумагу для проверки исходного pH, добавив 1 μL 1 N гидроксида натрия (NaOH) и/или 1 N соляной кислоты (HCl) в ECM, по мере необходимости, и повторяйте до тех пор, пока pH не станет 7,2-7,4. Обеспечьте гомогенизацию раствора ECM путем пипетирования вверх и вниз, избегая образования пузырьков воздуха.
   3. Перенесите микроколонны с стерилизованными щипцами из посуды на шаге 1.4.3 в пустые 35- или 60-мм чашки Петри. Работайте на 4-5 микроколоннах за раз, чтобы предотвратить обезвоживание. Прикрепите наконечник объемом 10 мкл к наконечнику объемом 1 000 мкл к микропипетке. Используя стереоскоп для визуального наведения, поместите наконечник на один конец микроколонок и всасывайте для извлечения остаточных DPBS и пузырьков воздуха из просвета.
   4. Быстро наберите 4-5 мкл ЭКМ в микропипетке. Наблюдая под стереоскопом, поместите кончик микропипетки на один из концов микроколонок и выпустите достаточное количество ЭХМ, чтобы заполнить просвет. Подтвердите отсутствие пузырьков воздуха в просвете, так как они могут препятствовать вырастанию аксонов через ВКМ. Если пузырьки воздуха существуют, извлеките ЭБУ, как описано в шаге 3.1.3, и снова добавьте ЭБУ.
   5. Чтобы предотвратить обезвоживание, добавьте ~2 мкл ECM вокруг каждой микроколонки. Инкубируйте микроколонки гидрогеля/ECM в чашках Петри при 37 °C и 5%_CO2 в течение 25 минут. Приступайте к посеву клеток сразу после инкубации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубационный период на шаге 3.1.5 предназначен для того, чтобы дать время для полимеризации коллагена и ламинина внутри микроколонок.
2. Посев нейрональных клеток в микроколонках
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы изменить питательную среду трансдуцируемых агрегатов, наклоните планшет, с помощью микропипетки удалите среду, которая скапливается на стенке лунки, а затем медленно добавьте ~1 мл к стенке (чтобы не нарушить агрегаты в пирамидальных микролунках). Повторите это изменение среды во второй раз.
   1. После инкубационного периода на шаге 3.1.5 перенесите примерно 10-20 μL питательной среды в две свободные области в чашках Петри, где находятся микроколонны. С помощью микропипетки по отдельности перенесите агрегаты в чашку Петри, содержащую конструкции, и переместите их с помощью щипцов в один из небольших бассейнов питательной среды для сохранения здоровья клеток.
   2. Во время наблюдения под стереоскопом вставьте агрегат на каждый конец микроколонок для двунаправленных микро-ТЕННОВ или на один конец для однонаправленной архитектуры (по желанию) с помощью щипцов. Подтвердите расположение агрегатов внутри микроколонн с помощью стереоскопа. С помощью щипцов переместите засеянные микроколонны в другой небольшой бассейн питательной среды, чтобы избежать обезвоживания и сохранить здоровье агрегатов.
   3. Инкубируйте при 37 °C и 5%_CO2 в течение 45 минут, чтобы заполнители прилипли к ECM. С помощью стереоскопа убедитесь, что агрегаты остаются на концах микроколонок; Повторно введите клеточные агрегаты и при необходимости повторите этап инкубации.
   4. Осторожно залейте чашки Петри, содержащие микро-ТЭННы, питательной средой (3 или 6 мл для чашки Петри 35 или 60 мм соответственно) с помощью серологической пипетки. Поместите чашки в инкубатор при температуре 37 °C и 5%_CO2 для длительного культивирования.
   5. Каждые 2 дня выполняйте смену полусреды с помощью питательной среды. Осторожно удалите половину старого носителя с помощью пипетки и используйте стереоскоп для визуального контроля, чтобы избежать отсасывания микро-ТЭНов. Замените на медленно добавляйте свежую, предварительно подогретую среду с помощью пипетки.

Результаты

Рисунок 1: Чертежи вырезанного лазером устройства для изготовления микроколонн и напечатанной на 3D-принтере пирамидальной микролунки для агрегации клеток. (A)-(B) Чертеж и изображение нижней и верхней половин цилиндрической матрицы каналов, соответственн...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Лазерный резак	Универсальные лазерные системы	PLS4.75	Используется для изготовления микроканальной формы, вырезанной лазером.
Устройство для изготовления микроколонн лазерной резкой	по индивидуальному заказу	--------------	Свяжитесь с нашей исследовательской группой, если заинтересованы. Размеры и чертежи представлены в рукописи.
Винты	--------------	--------------	#4-40 с диаметром резьбы 3,05 мм
Гайки	--------------	--------------	#4-40 с диаметром резьбы 3,05 мм
Игла иглоукалывания (диаметр 180 мкм)	Lhasa medical	sj.16X40	Диаметр может быть изменен в зависимости от желаемого размера для просвета микроколонки.
Чашка	Петри Fisher	08772B
Фосфатно-солевой буферный раствор Дульбекко (DPBS)	Инвитроген	14200075
Полистирол одноразовая серологическая пипетка	Fisher	13-678-11D
Agarose	Sigma	A9539-50G
Капиллярная трубка (диаметр 398 мкм)	Fisher	21170D	Диаметр может быть изменен в зависимости от желаемого размера оболочки микроколонны.
Горячая пластина	Fisher	SP88857200
Магнитный стержень	Fisher	1451352
Микропипетка	Sigma	Z683884-1EA
Игла калибра 25 мм	Fisher	14-826-49
Микроскальпель	Roboz хирургические	RS-6270
Ножницы	Тонкие научные инструменты	14081-09
Щипцы	Мировые прецизионные инструменты	501985
Стерилизатор горячих шариков	Sigma	Z378550-1EA
Стереоскоп	Nikon	SMZ800N	Используется для всех этапов вскрытия и для изготовления микро-ТЕН.
Коллаген Corning типа I типа 354236			Поддерживайте при температуре 4 ºC и удаляйте только при необходимости. Используйте лед, чтобы сохранить его температуру во время использования.
Микроцентрифужная пробирка	Fisher	02-681-256
Мышиный ламинин	Corning	354232	Поддерживать при температуре 4 ºC и удалять только при необходимости. Используйте лед, чтобы сохранить его температуру во время использования.
Нейробазальная среда	Инвитроген	21103049	Базальная среда для культивирования пренатальных и эмбриональных нейрональных клеток. Перед использованием хранить при температуре 4ºC и нагревать до 37 ºC.
Гидроксид натрия (NaOH)	Fisher	SS2661
Соляная кислота (HCl)	Fisher	SA48-1
Лакмусовая бумага	Fisher	09-876-18
Сбалансированный раствор соли Хэнка (HBSS)	Инвитроген	14170112	хранить при температуре 4 ºC.
0,25% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200056	хранить при температуре -20 ºC и нагревать до 37 ºC перед использованием.
Панкреатическая дезоксирибонуклеаза (ДНКаза) крупного рогатого скота I	Sigma	10104159001	хранить при температуре -20 ºC и нагревать до 37 ºC перед использованием.
B-27 Добавка	Invitrogen	12587010	Добавка, добавленная в нейробазальную среду для культивирования нейронов гиппокампа и коры головного мозга. Перед использованием хранить при температуре -20 ºC и нагревать до 37 ºC.
L-глютамин	Invitrogen	35050061	хранить при температуре -20 ºC и нагревать до 37 ºC перед использованием.
Спрэг Доули эмбриональный день 18 крыс	Чарльз	Ривер Штамм 001
Пастер пипетка	Фишер	22-042816
15 мл центрифуга пробирка	EMESCO	1194-352099
Vortex	Фишер	02-215-414
Центрифуга	Фишер	05-413-115
Гемоцитометр	Fisher	02-671-6
3D-принтер Objet30	Stratasys	--------------	Используется для изготовления пирамидальных форм для микролунок.
3D-печатная форма для пирамидального колодца	на заказ	--------------	Свяжитесь с нашей исследовательской группой, если заинтересованы. Размеры и чертежи представлены в рукописи.
Полидиметилсилоксан (PDMS) и отвердитель	Fisher	NC9285739	Поставляется в комплекте с эластомером и отвердителем. Используйте внутри вытяжного шкафа для химикатов.
Воронка	Fisher	10-348C
1 мл колба для пипетки	Sigma	Z509035
Микрошпатель	Fisher	S50821
12-луночная культуральная пластина	EMESCO	1194-353043
Духовка	Fisher	11-475-154
Инкубатор	Fisher	13 998 076
Микроскоп Eclipse Ti-S	Nikon	--------------	Используется для получения фазово-контрастных изображений. С помощью цифровой съемки изображений с помощью фотоаппарата QiClick, сопряженного с программным обеспечением для базовых исследований Nikon Elements (4.10.01).