Этот метод позволяет характеристика расширенных бактериальные культуры совместно с EpiAirways, первичных человеческих дыхательных эпителиальных тканей, выращенных при воздушно-жидкостной интерфейс, биологически значимых В пробирке Модели. Подход может быть использован с любым микробом, потенциально пригодных для долгосрочного со-культуры.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Использование EpiAirway модель Характеризуя Долгосрочные хост-возбудителя Взаимодействия
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Nontypeable гемофильной инфекции (NTHi) являются человеческими адаптированных грамотрицательные бактерии, способные вызвать рецидивирующих и хронических инфекций дыхательных слизистой оболочки 1, 2. Для изучения механизмов, посредством которых эти организмы выживают и внутри дыхательной ткани, модели, в которой успешное долгосрочное сотрудничество-культуры бактерий и клеток человека могут быть выполнены не требуется. Мы используем первичных человеческих дыхательных эпителиальных тканей поднял в воздух-жидкость, модель EpiAirway (Маттек, Ashland, MA). Это без увековечено, хорошо дифференцированные, 3-мерный тканей, содержащих плотные соединения, мерцательного и nonciliated клеток, бокаловидных клеток, которые производят муцина и сохраняют способность вырабатывать цитокины в ответ на инфекцию.
Это биологически значимых в пробирке модель человеческого верхних дыхательных путей могут быть использованы в ряде способами; Общая цель этого метода заключается в проведении долгосрочных со-культуры EpiAirway тканей с NTHi и количественного клеточно-ассоциированных бактерий и внутренним течением времени . Кроме того, муцин производства и цитокинового профиля зараженного со-культур может быть определена. Такой подход улучшает существующие методы в том, что многие современные протоколы используют погруженные монослоя или Transwell культурах человеческих клеток, которые не способны поддерживать бактериальных инфекций в течение длительного периода 3. Например, если организм может размножаться в вышележащих средства массовой информации, это может привести к недопустимым уровням цитотоксичность и потери клеток хозяина, арестовав эксперимента. EpiAirway модель позволяет характеристику долгосрочного хозяин-патоген взаимодействий. Далее, поскольку источником EpiAirway является нормальной человеческой трахеобронхиального клеток, а не увековечена линия, каждый из них отличное представление реальной человеческой ткани верхних дыхательных путей, как в структуре и функции 4.
Для этого метода EpiAirway ткани отлучить от антимикробных и противогрибковых соединений в течение 2 дней до родов, и все процедуры проводятся под антибиотикам свободных условиях. Это требует специального рассмотрения, так как бактерии и первичных человеческих тканей, используемых в одном шкафу биобезопасности, и совместно культивировали в течение длительного периода времени.
Протокол
1. Подготовка кабинета биобезопасности EpiAirway тканей
- Ношение посвященный халате, с волосами, связанными назад и перчатки, начните ламинарного потока. Через 5 минут, перемещать любые инструменты в шкафу (пипетки, советы, центрифужные пробирки и т.д.) в одну сторону, спрей интерьера кабинета биобезопасности и створки с 70% этанола и протрите чистой салфеткой. Спрей очищены интерьера снова с 70% этанола и оставляют для просушки. Перемещение средств для чистой стороны и повторите процедуру этанола.
- Использование аэрозолей барьер наконечники пипеток и посвятил в шкафу. Чтобы использовать индивидуально обернутые стерильной серологических пипеток, проходят подключен конец через ламинарный поток, взломать, и слайд-пипетки в кабинет, отбрасывая упаковку снаружи.
- EpiAirway вставки должны быть обработаны с стерильных щипцов. Место 6-дюймовый тонкий кончик изогнутой рассекает щипцов в самоуплотняющихся стерилизации сумки и автоклав. Подготовка достаточно иметь по крайней мере шесть в день готов к использованию.
2. Распаковка EpiAirway тканей
- Спрей рабочей поверхности в биобезопасности шкаф с 70% этанола и протрите чистой салфеткой. Спрей снова и дайте поверхности высохнуть перед использованием. Открытое EpiAirway окно и выбросьте пенополистирола и упаковочный материал.
- EpiAirway антибиотикам бесплатное техническое обслуживание средств массовой информации, AIR-100-MM ABF (ММ), является собственностью Маттек и отправляется в комплекте с вставками. В биобезопасности кабинета, этикетка шесть стерильные 50 мл пробирок с центрифугой типа носителя и дату, и ослабьте крышки. Спрей бутылку средства массовой информации с 70% этанола и открытых внутри шкафа. Алиготе 25 мл М.М. в каждую пробирку с использованием нового стерильного серологические пипетки для каждой трубки, затяните шапки, и хранить при температуре 4 ° C. Использование свежей аликвоты ММ каждый день.
- Повторите 2,2 выше, с использованием свежих бутылку 1 X Дульбеко фосфатным буферным раствором (D-PBS) с кальцием и магнием. Повторите еще раз, используя D-ФСБ без кальция и магния. Храните все аликвот при 4 ° C.
- EpiAirway вставками AIR-100 прибудет в 24-луночного планшета при 4 ° С на твердых средах содержащих агарозы, и должны быть помещены в 6-луночных планшетах для использования. На каждом плита с датой и описание использования этанола устойчивых к маркеру. Поместите 1 миллилитр 4 ° C EpiAirway ММ в каждую лунку. Удалить транспорта пластину из упаковки, спрей с 70% этанола, и место в шкафу биобезопасности. Удалите ленту и откройте пластину. Использование автоклавного щипцы, удалите влажной марлей над EpiAirway вставками.
- Возьмите вкладыш с использованием щипцов автоклавного вращательным движением, чтобы помочь в освобождении его от агарозы, и поместить в хорошо из 6-луночный планшет. Некоторые агарозы может присоединиться к вставке, в частности, так как температура транспорта пластины увеличивается до температуры окружающей среды. Использование стерильной ватной палочкой, чтобы тщательно удалить из агарозы вставки. Не прикасайтесь к мембране, и убедитесь, что нет пузырьков воздуха под вставками. Место пластинки в увлажненных 37 ° C инкубаторе с 5% CO 2.
- Позвольте по крайней мере 24 часов для тканей, чтобы уравновесить в инкубаторе перед началом совместного культур.
3. Поддержание EpiAirway тканей
- Использование автоклавного щипцы, забрать вставки и слегка пипетки 200 мкл подогретого D-PBS с кальцием и магнием на ткани и рок-вставки. Tilt вставки под углом, и разместить стерильной кончика пипетки P1000 с пластиковым кольцом, который содержит мембрану в нижней части вставки. Не прикасайтесь к ткани. Аспирируйте D-PBS промыть и поместить в стерильный помечены криопробирку. Образцы могут быть заморожены при температуре -20 ° С и анализировали на муцин и / или экспрессию цитокинов на более поздний срок.
- Изменение базальной ММ ежедневно аспирационных и замене с 1 мл свежей ММ. Используйте новый наконечник пипетки барьер для каждой скважины. Лечить использовать средства массовой информации с 10% отбеливателя в ночное время и выбросить.
4. Прививка EpiAirway тканей
- Подряд из свежих культуры nontypeable гемофильной инфекции (NTHi) из замороженных фондовом глицерина на шоколадный агар. Вырасти на ночь в увлажненной 5% СО 2 инкубатора.
- На следующий день, ресуспендируют одной колонии в NTHi подогретого D-PBS с кальцием и магнием, чтобы OD (600 нм) примерно 0,7. Vortex энергично перед измерением оптической плотности. Отношение оптической плотности в колониеобразующих единиц на миллилитр (КОЕ / мл) NTHi в том, что О. Д. (600 нм) 0,2 примерно равно 1,0 х 10 8 КОЕ / мл. Таким образом, О. Д. (600 нм) 0,7 составляет около 3,5 · 10 8 КОЕ / мл. Этот алгоритм должен быть утвержден для каждого штамма NTHi перед посевом.
- EpiAirway тканей AIR-100 выращивают на пластины с площадью поверхности 0,6 см 2 и 0,4 микрона мембраны. Ткани состоят из ~ 8,0 х 10 5 до ~ 1,0 х 10 6 </ SUP> клеток. Таким образом, прививки от 1,0 х 10 7 КОЕ соответствует множественность заражения около 10 - 12. Чтобы привить, промойте каждую EpiAirway вставить как в 3.1, а затем добавить 28 мкл бактериальной суспензии, приготовленной в 4,2 до апикальной поверхности каждого EpiAirway вставить в кабинете биобезопасности. Не прививать базальной ММ. Вернуться к каждой пластине инкубатора.
5. Количественная оценка NTHi посевной
- Подготовка фосфатным буферным раствором (PBS), решение с 0,1% желатина (PBS-G), автоклав для стерилизации. Этикетка стерильный 1,5 мл Eppendorf труб с желаемой 1:10 разведения на основе OD (600 нм) и посевной аликвоту 900 мкл стерильной PBS-G в каждую пробирку.
- Определить количество шоколада агаром необходимо перечислить прививку NTHi. Место этих пластин в воздухе инкубатора с ног на голову с нижней части пластины опираясь на половину верхней течение одного часа. Это позволит пластины как теплая до 37 ° С и поверхности высохнуть, облегчая раскрывающемся обшивки NTHi.
- Начало серийных разведений 1:10 посевной путем добавления 100 мкл бактериальной суспензии с 4,2 до первой трубы. Vortex каждого разведения энергично в течение 5 секунд до внесения следующего. Оставьте 10 мкл аликвот на подогретого и поверхностных высушенные пластины шоколадный агар, используя половину пластины для каждого разведения. Пять-шесть аликвоты 10 мкл может поместиться на одной половине каждого 100 мм пластины, не запуская вместе. При сухой, место с ног на голову в увлажненной 37 ° C CO 2 инкубаторе на ночь.
- На следующий день, определить КОЕ / мл, считая разведения, которые имеют 15-30 различных колоний в каждой капле и расчета на ваш фактический жизнеспособной инокулятом NTHi.
6. Долгосрочное сотрудничество культуры с NTHi
- Каждые 24 часа, мыть вставки, как в 3.1, то бассейн стирок каждой ткани, которая была сделана прививка с тем же штаммом бактерии и замерзает при -20 ° С в меченых криопробирку для последующего анализа. Эти образцы могут быть исследованы на наличие муцин от точки или пятна на выражение цитокинов ELISA. Кроме того, ткани могут быть собраны для мРНК и КПЦР может быть выполнена на гены интерес. Изменение базальной ММ ежедневно, как в п. 3.2. Продолжить в течение всего срока совместной культуры.
7. Заготовка EpiAirway тканей
- Подготовка свежей 1% раствора сапонина в D-ФСБ без кальция и магния, фильтр-стерилизовать и теплой до 37 ° C.
- Теплая 50 мл трубки ММ и другой Д-ФСБ без кальция и магния до 37 ° C.
- Подготовка разведения труб, как в 5.1, а также один пустой стерильный 1,5 мл Eppendorf туба на вставке, помечены числа вставки и NTHi напряжения.
- EpiAirways могут быть собраны как для общего клеточно-ассоциированных бактерий, которые включает в себя как приверженца и внутреннюю организмов, или по внутренним бактерий только.
- Определить количество пластин шоколадный агар необходимо отказаться от пластины клеточно-ассоциированных или атаке NTHi, этикетки и сухой в течение одного часа в воздухе, как в инкубаторе 5.2.
- Для уборки общего клеточно-ассоциированных бактерий, промыть апикальной поверхности EpiAirways три раза с 200 мкл D-ФСБ без кальция или магния, то наклон вставки и промыть все оставшиеся мм от базальной мембраны. Первой стирки можно заморозить для последующего анализа; отказаться от следующих стирок.
- Место мыть вставить в свежий 6-луночный планшет без М.М., и пипетка 250 мкл стерильной 1% сапонина решение с 7,1 на апикальной поверхности каждой ткани. Вернуться в инкубаторе в течение 10 минут.
- Удалить из инкубатора, и с помощью стерильной пипетки P1000, скраб ткани от мембраны использованием возвратно-поступательное движение, а затем круговыми движениями, чтобы удалить ткань от краев вставки. Использование большого диаметра стерильным наконечником пипетки P1000, места подвески в пустые трубки помечены подготовлен в 7,3. Добавьте 250 мкл D-ФСБ без кальция или магния на апикальной поверхности вставки.
- Изучить вставки диска с помощью перевернутого фазово-контрастным микроскопом, чтобы определить, есть ли оставшиеся ткани, которая будет собрана. Если необходимо, скраб снова с другим стерильным P1000 пипетки, затем добавить эту суспензию в пробирку с 7,8 использованием большого диаметра стерильным наконечником пипетки P1000. Довести общий объем трубки до 1 миллилитр использованием D-ФСБ без кальция или магния.
- Энергично вихрь клеточной суспензии на максимальной скорости в течение одной минуты. Используя стерильный шприц 1 мл оснащены 26 иглы, аспирация суспензии в шприц через иглу. Медленно проходит суспензии через иглу в 3 раза, следя за тем, чтобы не создавать пузыри. Vortex энергично снова в течение одной минуты.
- Использование большого диаметра пипетки, место 100 мкл суспензии в первую трубу разбавления подготовлен в 7.3. Vortex энергично в течение пяти секунд, а затем сделать серийный 1:10 разведений. Drop-пластина желаемого разведения на поверхность высушенного пластин шоколадный агар.
- Для уборки внутренним бактерий только, мыть каждой вставки в 3 раза с 200 мкл D-ФСБ без кальция или магния. Сохраняйте и заморозить первой стирки. Добавить гентамицин сульфата подогретого ММ до конечной концентрации 100 мкг / мл. Подготовка 1,5 мл среды на вставке быть собраны. Замените базальной ММ с гентамицином содержащих М.М., и добавьте 300 мкл гентамицин содержащих ММ на апикальной поверхности. Место пластины обратно в CO 2 инкубаторе в течение одного часа.
- Удалить гентамицин содержащих мм от апикальной поверхности и мыть апикальной поверхности и базальной мембраны вставить экстенсивно с подогретого D-ФСБ без кальция и магния. Выполните в 7.7-7.11.
8. Представитель результаты:
Сканирующей электронной микрофотографии (А.) неинфицированных тканей EpiAirway и (б) ткани после 5-дневной совместной культуре с NTHi показаны на рисунке 1. Долгосрочное сотрудничество культуры с NTHi не привести к значительному повреждению апикальной тканей, что подчеркивает полезность EpiAirway модели. График, иллюстрирующий количество интернализованных бактерии количественно с течением времени внутри тканей показано на рисунке 2. Оба результата достаточно воспроизводимым, делая EpiAirway тканей последовательной и биологически значимых в пробирке модель человеческого верхних дыхательных путей, в котором для изучения NTHi хозяин-патоген взаимодействий.
Рисунок 1. Сканирующей электронной микроскопии EpiAirway тканей. А. неинфицированных тканей контроля. Б. тканей после пяти дней со-культуры с NTHi. Нет значительного ущерба апикальной поверхности наблюдается в пораженных тканях.
Рисунок 2. Количество NTHi внутренним течением времени во время EpiAirway совместно культуры. Штамм R2866 инокулировали примерно 1,0 х 10 7 КОЕ / вставки (день 0), затем собирают на внутреннюю бактерий на каждой указанной точке времени. Столбики показывают п = 3 повторяет по крайней мере в двух экземплярах. Ошибка бары SD.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Этот метод позволяет исследовать долгосрочные хозяин-патоген взаимодействий в биологически значимых фоне первичных человеческих тканей дыхательной на воздух-жидкость. Здесь мы использовали NTHi как заражение организма, но взаимодействие любых бактерия, которая не вносит неприемлемые цитотоксичности с течением времени может быть определена количественно с помощью этого метода. EpiAirway модель также может быть использован для изучения вирусов, наркотиков или химических веществ, которые влияют на человека верхних дыхатель...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Мы хотели бы поблагодарить Патрика Хэйден (Маттек) за полезные обсуждения, и Роберт Смит и Либби Перри Грузии медицинских наук университета за их навыки EM. Это исследование было профинансировано NIDCD грант DC010187 в DAD
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Название реагента | Компания | Catalogue # | Комментарии |
| Saponin | Calbiochem | 558255-25GM | 1% в D-ФСБ без кальция или магния, фильтруют стерилизовать |
| 1 X Дульбеко фосфатным буферным раствором с кальцием и магнием | Lonza | 17-513Q | |
| 1 X Дульбеко фосфатным буферным раствором без кальция или магния | Lonza | 17-515Q | |
| EpiAirway антибиотиков тканей | Маттек | AIR-100-ABF | |
| EpiAirway антибиотикам свободных СМИ обслуживание | Маттек | AIR-100-MM-ABF | Поставляется с комплектом |
| 10X фосфатным буферным раствором решение | EMD | 6506 | Развести в 1X перед использованием |
| Желатин | JT Baker | 2124-01 | Добавить в конечной концентрации 0,1% в 1 X PBS и автоклавного |
| Difco GC Средний базы (шоколадный агар) | VWR | 90002-016 | Автоклав 36 г в 500 мл DDH 2 O и охладить до 60 ° C |
| BBL Гемоглобин (шоколадный агар) | VWR | 90000-662 | Автоклав 10 г в 500 мл DDH 2 O, охладить до 60 ° C и смешать с GC база среды выше |
| BD BBL IsoVitaleX обогащения (шоколадный агар) | VWR | 90000-414 | Охладите смесь ГК базе средних и гемоглобина до 55 ° С и добавляют 10 мл регидратации IsoVitaleX, залить пластин шоколадный агар |
| Анатомический пинцет, тонкий наконечник, изогнутые | VWR | 82027-406 | |
| Самоуплотняющееся мешочки стерилизации | VWR | 89140-802 | |
| Гентамицин сульфат, 10 мг / мл | Lonza | 17-519Z | Добавить 10 мкл / мл до EpiAirway ММ для гентамицин убить |
Ссылки
- Murphy, T. F., Apicella, M. A. Nontypeable Haemophilus influenzae: a review of clinical aspects, surface antigens, and the human immune response to infection. Rev. Infect. Dis. 9, 1-15 (1987).
- Murphy, T. F., Faden, H., Bakaletz, L. O., Kyd, J. M., Forsgren, A., Campos, J., Virji, M., Pelton, S. I. Nontypeable Haemophilus influenzae as a pathogen in children. Ped. Infect. Dis. J. 28, 43-48 (2009).
- Hotomi, M., Arai, J., Billal, D. S., Takei, S., KIkeda, Y., Ogami, M., Kono, M., Beder, L. B., Toya, K., Kimura, M., Yamanaka, N. Nontypeable Haemophilus influenzae isolated from intractable acute otitis media internalized into cultured human epithelial cells. Auris Nasus Larynx. 37, 137-144 (2010).
- Chemuturi, N. V., Hayden, P., Kalausner, M., Donovan, M. D. Comparison of human tracheal/bronchial epithelial cell culture and bovine nasal respiratory explants for nasal drug transport studies. J. Pharm. Sci. 94, 1976-1985 (2005).
- Sharma, M., Schoop, R., Hudson, J. B. The efficacy of Echinacea in a 3-D tissue model of human airway epithelium. Phytother. Res. 24, 900-904 (2010).
- Sexton, K., Balharry, D., BeruBe, K. A. Genomic biomarkers of pulmonary exposure to tobacco smoke components. Pharmacogenet Genomics. 10, 853-860 (2008).
- Babu, R. J., Dayal, P., Singh, M. Effect of cyclodextrins on the complexation and nasal permeation of melatonin. Drug Deliv. 6, 381-388 (2008).
- Balharry, D., Sexton, K., BeruBe, K. A. An in vitro approach to assess the toxicity of inhaled tobacco smoke components: nicotine, cadmium, formaldehyde and urethane. Toxicology. 244, 66-76 (2008).
- Fahy, J. V., Dickey, M. D. Airway mucus function and dysfunction. N. Engl. J. Med. 363, 2233-2247 (2010).
- Huang, Y., Mikami, F., Jono, H., Zhang, W., Weng, X., Koga, T., Xu, H., Yan, C., Kai, H., Li, J. -D. Opposing roles of PAK2 and PAK4 in synergistic induction of MUC5AC mucin by bacterium NTHi. 359, 691-696 (2007).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
