Этот метод позволяет характеристика расширенных бактериальные культуры совместно с EpiAirways, первичных человеческих дыхательных эпителиальных тканей, выращенных при воздушно-жидкостной интерфейс, биологически значимых В пробирке Модели. Подход может быть использован с любым микробом, потенциально пригодных для долгосрочного со-культуры.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Использование EpiAirway модель Характеризуя Долгосрочные хост-возбудителя Взаимодействия
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Nontypeable гемофильной инфекции (NTHi) являются человеческими адаптированных грамотрицательные бактерии, способные вызвать рецидивирующих и хронических инфекций дыхательных слизистой оболочки 1, 2. Для изучения механизмов, посредством которых эти организмы выживают и внутри дыхательной ткани, модели, в которой успешное долгосрочное сотрудничество-культуры бактерий и клеток человека могут быть выполнены не требуется. Мы используем первичных человеческих дыхательных эпителиальных тканей поднял в воздух-жидкость, модель EpiAirway (Маттек, Ashland, MA). Это без увековечено, хорошо дифференцированные, 3-мерный тканей, содержащих плотные соединения, мерцательного и nonciliated клеток, бокаловидных клеток, которые производят муцина и сохраняют способность вырабатывать цитокины в ответ на инфекцию.
Это биологически значимых в пробирке модель человеческого верхних дыхательных путей могут быть использованы в ряде способами; Общая цель этого метода заключается в проведении долгосрочных со-культуры EpiAirway тканей с NTHi и количественного клеточно-ассоциированных бактерий и внутренним течением времени . Кроме того, муцин производства и цитокинового профиля зараженного со-культур может быть определена. Такой подход улучшает существующие методы в том, что многие современные протоколы используют погруженные монослоя или Transwell культурах человеческих клеток, которые не способны поддерживать бактериальных инфекций в течение длительного периода 3. Например, если организм может размножаться в вышележащих средства массовой информации, это может привести к недопустимым уровням цитотоксичность и потери клеток хозяина, арестовав эксперимента. EpiAirway модель позволяет характеристику долгосрочного хозяин-патоген взаимодействий. Далее, поскольку источником EpiAirway является нормальной человеческой трахеобронхиального клеток, а не увековечена линия, каждый из них отличное представление реальной человеческой ткани верхних дыхательных путей, как в структуре и функции 4.
Для этого метода EpiAirway ткани отлучить от антимикробных и противогрибковых соединений в течение 2 дней до родов, и все процедуры проводятся под антибиотикам свободных условиях. Это требует специального рассмотрения, так как бактерии и первичных человеческих тканей, используемых в одном шкафу биобезопасности, и совместно культивировали в течение длительного периода времени.
Протокол
1. Подготовка кабинета биобезопасности EpiAirway тканей
- Ношение посвященный халате, с волосами, связанными назад и перчатки, начните ламинарного потока. Через 5 минут, перемещать любые инструменты в шкафу (пипетки, советы, центрифужные пробирки и т.д.) в одну сторону, спрей интерьера кабинета биобезопасности и створки с 70% этанола и протрите чистой салфеткой. Спрей очищены интерьера снова с 70% этанола и оставляют для просушки. Перемещение средств для чистой стороны и повторите процедуру этанола.
- Использование аэрозолей барьер наконечники пипеток и посвятил в шкафу. Чтобы использовать индивидуально обернутые стерильной серологических пипеток, пр....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Этот метод позволяет исследовать долгосрочные хозяин-патоген взаимодействий в биологически значимых фоне первичных человеческих тканей дыхательной на воздух-жидкость. Здесь мы использовали NTHi как заражение организма, но взаимодействие любых бактерия, которая не вносит неприемлемые цитотоксичности с течением времени может быть определена количественно с помощью этого метода. EpiAirway модель также может быть использован для изучения вирусов, наркотиков или химических веществ, которые влияют на человека верхних дыхатель.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Мы хотели бы поблагодарить Патрика Хэйден (Маттек) за полезные обсуждения, и Роберт Смит и Либби Перри Грузии медицинских наук университета за их навыки EM. Это исследование было профинансировано NIDCD грант DC010187 в DAD
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Название реагента | Компания | Catalogue # | Комментарии |
| Saponin | Calbiochem | 558255-25GM | 1% в D-ФСБ без кальция или магния, фильтруют стерилизовать |
| 1 X Дульбеко фосфатным буферным раствором с кальцием и магнием | Lonza | 17-513Q | |
| 1 X Дульбеко фосфатным буферным раствором без кальция или магния | Lonza | 17-515Q | |
| EpiAirway антибиотиков тканей | Маттек | AIR-100-ABF | |
| EpiAirway антибиотикам свободных СМИ обслуживание | Маттек | AIR-100-MM-ABF | Поставляется с комплектом |
| 10X фосфатным буферным раствором решение | EMD | 6506 | Развести в 1X перед использованием |
| Желатин | JT Baker | 2124-01 | Добавить в конечной концентрации 0,1% в 1 X PBS и автоклавного |
| Difco GC Средний базы (шоколадный агар) | VWR | 90002-016 | Автоклав 36 г в 500 мл DDH 2 O и охладить до 60 ° C |
| BBL Гемоглобин (шоколадный агар) | VWR | 90000-662 | Автоклав 10 г в 500 мл DDH 2 O, охладить до 60 ° C и смешать с GC база среды выше |
| BD BBL IsoVitaleX обогащения (шоколадный агар) | VWR | 90000-414 | Охладите смесь ГК базе средних и гемоглобина до 55 ° С и добавляют 10 мл регидратации IsoVitaleX, залить пластин шоколадный агар |
| Анатомический пинцет, тонкий наконечник, изогнутые | VWR | 82027-406 | |
| Самоуплотняющееся мешочки стерилизации | VWR | 89140-802 | |
| Гентамицин сульфат, 10 мг / мл | Lonza | 17-519Z | Добавить 10 мкл / мл до EpiAirway ММ для гентамицин убить |
Ссылки
- Murphy, T. F., Apicella, M. A. Nontypeable Haemophilus influenzae: a review of clinical aspects, surface antigens, and the human immune response to infection. Rev. Infect. Dis. 9, 1-15 (1987).
- Murphy, T. F., Faden, H., Bakaletz, L. O., Kyd, J. M., Forsgren, A., Campos, J., Virji, M., Pelton, S. I.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Больше статей
