Визуализация митохондриальной дыхательной функции использованием цитохрома C Оксидазы / сукцинатдегидрогеназы (ЦОГ / SDH) Дважды маркировки гистохимии

Summary

Цитохром с оксидазы / натрия дегидрогеназы (ЦОГ / SDH) двойной маркировки метод позволяет для прямой визуализации митохондриальных дыхательных ферментов недостатки в свежезамороженных срезах тканей. Это просто гистохимические техники и полезен в расследовании митохондриальных болезней, старения и связанных со старением заболеваний.

Abstract

Дефекты митохондриальной ДНК (мтДНК) являются важной причиной заболеваний и могут лежать в основе старения и связанных со старением изменений ^1,2. Митохондриальная теория старения предполагает роль мутаций мтДНК, которые могут изменять биоэнергетический гомеостаз и клеточную функцию, в процессе старения ³. В поддержку этой теории было собрано множество доказательств ^1,4, примером которых является мышь-мутатор мтДНК ⁵; однако точная роль повреждения мтДНК в старении до конца не изучена ^6,7.

Наблюдение за активностью дыхательных ферментов является прямым подходом к исследованию митохондриальной дисфункции. Комплекс IV, или цитохром с оксидаза (ЦОГ), необходим для функции митохондрий. Каталитические субъединицы ЦОГ кодируются мтДНК и необходимы для сборки комплекса (рис. 1). Таким образом, правильный синтез и функционирование в значительной степени основаны на целостности мтДНК ². Несмотря на то, что могут быть исследованы и другие дыхательные комплексы, комплексы IV и II наиболее поддаются гистохимическому исследованию ^8,9. Комплекс II, или сукцинатдегидрогеназа (SDH), полностью кодируется ядерной ДНК (рис. 1), и его активность обычно не зависит от нарушенной мтДНК, хотя увеличение может указывать на митохондриальный биогенез ^10-12. Нарушение мтДНК, наблюдаемое при митохондриальных заболеваниях, старении и возрастных заболеваниях, часто приводит к наличию клеток с низкой или отсутствующей активностью ЦОГ ^2,12-14. Несмотря на то, что активность ЦОГ и СДГ может быть исследована по отдельности, метод последовательного двойного мечения ^15,16 оказался эффективным при обнаружении клеток с митохондриальной дисфункцией ^12,17-21.

Многие из оптимальных составов анализа были определены, такие как концентрация субстрата, акцепторы/доноры электронов, промежуточные переносчики электронов, влияние рН и время реакции ^9,22,23. 3,3'-диаминобензидин (DAB) является эффективным и надежным донором электронов ²². В клетках с функционирующей ЦОГ полимерный продукт коричневого индамина будет локализоваться в митохондриальных кристаллах и насыщать клетки ²². Таким образом, клетки с дисфункционирующей ЦОГ не будут насыщаться продуктом DAB, что позволяет визуализировать активность SDH путем восстановления нитрозитразола (NBT), акцептора электронов, до конечного продукта ^9,24 синего формазана. Субстраты цитохрома с и сукцината натрия добавляются для нормализации эндогенных уровней между контрольными и больными/мутантными тканями ⁹. Каталазу добавляют в качестве меры предосторожности, чтобы избежать возможных реакций загрязнения от активности пероксидазы ^9,22. Феназин метосульфат (ПМС), промежуточный переносчик электронов, используется совместно с азидом натрия, ингибитором дыхательной цепи, для увеличения образования конечных продуктов реакции ^9,25. Несмотря на эту информацию, некоторые важные детали, влияющие на результат этого, казалось бы, простого анализа, в дополнение к контролю специфичности и достижениям в методе, еще не были представлены.

Protocol

1. Ткань подготовки к cryosectioning

1. Жертва животного или шейки дислокации или обезглавливание, в соответствии с имеющимися этических разрешения.
2. Быстро собирать тканей интерес (например,. Головной мозг), и быстро заморозить на сухом льду (ткани может потребовать замораживания в изопентан или пропан охлажденной жидким азотом для получения оптимального морфологии). Магазин тканей в алюминиевую фольгу при температуре -80 ° С до готовности разделе.
3. Добавить замороженные ткани при подготовке к cryosectioning.
4. Сбор 14-мкм разделы криостате при -21 ° C (возможно, потребуется скорректировать температуры ± 1-2 ° С). Оттепель ....

Discussion

Комбинированный ЦОГ / SDH гистохимические метод позволяет визуализации клеток с митохондриальной дисфункцией. Этот метод, с ранних исследований, начиная с 1968 года, остается популярным, и многие считая его «золотым стандартом» для выявления митохондриальных заболеваний у пациентов, ^14,19,26,27. В настоящее время часто используется для исследования митохондриальной ДНК мутации управляемой старения и старения расстройств, связанных с ^{12,13,18,20,21,24.} ЦОГ / SDH двойной маркировки метод часто исполь.......

Materials

Название реагента	Компания	Номер по каталогу	Комментарии (необязательно)
Сухой лед	AGA AB газа	блочном виде
Изопентан (2-метилбутан)	Sigma-Aldrich	277258 CAS: 78-78-4
Cyrostat вложение решение	Сакура Finetek	Ткань Tek 4583
Криостат	Microm	Microm Модель HM 500M
Слайды	Thermo Scientific	Супер Фрост Плюс Менцель Глезер J1800AMWZ
Обложка очки Боросиликатного стекла	VWR International	16004-098	24 х 50 мм
Фильтровальная бумага	Munktell фильтра AB	Качество: 1350 СтатьяКоличество: 242 001	430 х 430 мм
3,3 '-диаминобензидина tetrahydrochloride (DAB)	Sigma-Aldrich	Sigma Система жидкостного субстрата, D7304
Цитохром с (тип III, от лошадиного сердца)	Sigma-Aldrich	C2506 CAS: 9007-43-6
Говядина каталазы (из печени)	Sigma-Aldrich	C9322 CAS: 9001-05-2
Нитросинего тетразолия (NBT)	Sigma-Aldrich	N6876 CAS: 298-83-9
Натрия сукцинат	Sigma-Aldrich	S2378 CAS: 6106-21-4
Феназинметасульфат (ПМС)	Sigma-Aldrich	P9625 CAS: 299-11-6	ПМС светочувствительным. Щит от света месте.
Азид натрия	Sigma-Aldrich	S8032 CAS: 26628-22-8
Ксилол	VWR International	ЭМ-XX0060-4
Entellan	VWR International	100503-870
Малонат (Малоновая кислоты)	Sigma-Aldrich	M1296 CAS: 141-82-2