Методическая статья

Изменение направления и ориентации электрического поля во время применения электрических импульсов Улучшает плазмиды перенос генов В пробирке

DOI:

10.3791/3309

⸱

12 сентября 2011 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Fundamentals of Electrical Engineering, Mathematics and Physics, University of Ljubljana, 2Department of Biomedical Engineering, University of Ljubljana

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Гена трансфекции электропорацией улучшается примерно в два раза, когда ориентация электрического поля изменяется во время нанесения импульса, а жизнеспособность клеток не влияет. Увеличение трансфекции гена обусловлена ​​увеличением мембраны области, которая производится компетентным для ДНК вступления в клетке.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Гена электропереноса является физический метод используется для доставки генов в клетки путем применения коротких и интенсивных электрических импульсов, которые вызывают дестабилизацию клеточных мембран, что делает ее проницаемой для небольших молекул и позволяет передачу больших молекул, таких как ДНК. Он представляет собой альтернативу вирусные векторы, из-за его безопасность, эффективность и простота применения. Для гена электропереноса различных электрических импульсов протоколы используются для того, чтобы достичь максимальной трансфекции генов, один из них меняет направления электрического поля и ориентацию в течение импульса доставки. Изменение направления электрического поля и ориентации увеличение мембранного области компетентным для ДНК вступления в клетке. В этом видео, мы демонстрируем различие в гене эффективность электропереноса, когда все импульсы поступают в том же направлении и когда импульсы передаются путем изменения альтернативно направления электрического поля и ориентацию. Для этого наконечник со встроенным электродов и высоковольтной прототип генератора, который позволяет изменять электрического поля в разных направлениях во время применения электрических импульсов, были использованы. Гена электропереноса эффективность определяется 24 часов после применения в качестве импульса число клеток, экспрессирующих зеленый флуоресцентный белок разделить с числом всех клеток. Результаты показывают, что ген трансфекции увеличивается, когда электрические поля при ориентации электрических доставки импульс изменился.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Клеточные культуры, плазмиды и буферных подготовки к эксперименту

  1. В этом эксперименте яичника китайского хомячка клеток (СНО-К1) используются. Клетки, выращенные в питательной смеси HAM-F12 (ПАА) с добавлением 2 мМ L-глутамина, 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 400 мкл / л гентамицина (все от Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen, Германия), и 1 мл / л crystacilin (Плива, Загреб, Хорватия). Клетки хранятся при температуре 37 ° С в увлажненной 5% CO 2 в атмосферу инкубатора в течение 24 часов.
  2. Amplify плазмиды pEGFP-N1 (Clontech Laboratories, Inc, Mountain View, Калифорния, США), кодирующий зеленый флуоресцентный белок (GFP) в DH5α штамм кишечной палочки и изолировать его с HiSpeed ​​плазмиды Комплект Maxi (Qiagen, Hilden, Германия). Плазмиды концентрации ДНК (плазмиды, растворенных в ТЕ буфере) должна быть определена спектрофотометрически при 260 нм и подтвердил помощью гель-электрофореза.
  3. Подготовка isoosmolar буфера фосфата натрия (10 мМ Na 2 HPO 4, 10 мМ NaH 2 PO 4, 1 мМ MgCl 2, 250 мМ сахарозы, рН 7,4).
  4. В день эксперимента подготовить суспензии клеток путем трипсинизации с 0,25% трипсин / ЭДТА раствором (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen, Германия). Центрифуга клетки в течение 5 мин при 1000 оборотов в минуту (180 мкг) при 4 ° С (Sigma, Германия) и ресуспендируют осадок клеток в isoosmolar буфера фосфата натрия в клетку плотностью 5 × 10 6 клеток / мл.

2. Аппаратное оборудование

  1. Клетки подвергаются воздействию электрического поля в пипетки (рис. 1) с интегрированным электроды подключены к высоковольтной прототип генератора. Наконечник и геометрии электродов позволяет применение сравнительно однородное электрическое поле и генератор позволяет доставки электрических импульсов в разных направлениях. Наконечник и генератор были разработаны в лаборатории биокибернетики, факультет электротехники, Университет Любляны 1.

Рисунок 1
Рисунок 1. Вертикальная и горизонтальная () сечения и фотография (б) пипетки с интегрированным электродов. В разделе крест цвета серого используется для пластиковый корпус и черный для электродов. Пипетки с интегрированным электродов состоит из четырех цилиндрических электродов стержня. Электроды изготовлены из нержавеющей стали, их диаметр составляет 1,4 мм, прилегающие электроды 1 мм друг от друга, а напротив электродов 2 мм друг от друга. Электроды вклеены в пластиковый наконечник параллельно и применимых длина составляет 30 мм 2.

3. Гена электропереноса протокола

  1. Добавить плазмиды pEGFP-N1 к суспензии клеток в концентрации 10 мкг / мл.
  2. Выдержите смесь в течение 2-3 минут при комнатной температуре, перед применением электрических импульсов.
  3. Aspire 100 мкл клеточной суспензии в пипетку наконечник со встроенным электродов.
  4. Для достижения наилучших эффективность гена электропереноса и поддерживать жизнеспособность клеток, оптимальных параметров электрических импульсов должен быть использован. В этом эксперименте поезд 8 прямоугольных импульсов (каждая длительностью 1 мс, амплитудой 225 В при частоте повторения 1 Гц) применяется к каждому образцу, используя высоковольтные прототип генератора. Два различных электрических протоколов поля (рис. 2) используются: в первый протокол все импульсы передаются в одном направлении, тогда как во втором импульсов протокола поставляются путем изменения альтернативно направления электрического поля и ориентацию. Второй протокол может быть использован только с соответствующими генератора импульсов, что позволяет применение электрических импульсов в разных направлениях.
  5. Сразу после передачи импульса применение клетки от кончика пипетки на 6 лунками и добавить эмбриональной телячьей сыворотки (FCS-Sigma, США) (25% от объема выборки).
  6. Инкубируйте клетки в течение 5 мин при 37 ° С, чтобы опечатывания клеточной мембраны.
  7. Добавить 2 мл HAM-F12 для каждого образца в 6 и инкубировать клетки в течение 24 часов при 37 ° С в увлажненной 5% СО 2 атмосферы в инкубаторе.

Рисунок 2
. Рисунок 2 Электрическое поле протоколов: (а) все импульсы поступают в том же направлении, (б) импульсы передаются путем изменения альтернативно направления электрического поля и ориентацию.

4. Приобретение изображения и определение эффективности генной электропереноса

  1. Эффективность генной электропереноса определяется как процент клеток, экспрессирующих GFP 24 часов после импульса приложения.
  2. Клетки, наблюдаемые с помощью флуоресцентного микроскопа (в нашем случае Zeiss 200, Axiovert, З. Германия) при возбуждении светом в 488 нм, созданные с системой монохроматора (полихромные IV, Visitron, Германия) и излучения обнаружен на 507 нм. Изображения записываются с использованием изображений системы (Метаморф изображений системы, Visitrна, Германия), но и других подобных программ приобретения также могут быть использованы.
  3. Приобретайте не менее пяти изображений (фазового контраста и зеленая флуоресценция) в 20-кратным целью увеличения.
  4. Граф клеток в фазе контраста изображения и клетки, которые выражают GFP в зеленую флуоресценцию изображения. Определить процент генов эффективность электропереноса путем деления числа клеток, которые выражают GFP с числом всех клеток в каждом соответствующее изображение (рис. 3).

5. Представитель результаты:

Рисунок 3
Рисунок 3. Процент клеток, экспрессирующих GFP, когда все импульсы поступают в том же направлении и когда импульсы передаются путем изменения альтернативно направления электрического поля и ориентация представлена. Клетки подвергались поезд из восьми импульсов с амплитудой 225 В, длительность 1 мс и частотой повторения 1 Гц. Результаты были получены с помощью флуоресцентной микроскопии. Каждое значение в графе представляют собой среднее из трех независимых экспериментах ± стандартное отклонение. Путем изменения направления электрического поля и ориентации процент клеток, экспрессирующих GFP увеличивается.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Гена электропереноса это универсальный метод биотехнологии, который позволяет передачу ДНК в клетки с помощью применения Короче говоря, высоковольтных электрических импульсов 3 и представляет собой более безопасную альтернативу вирусные векторы, из-за его безопасность, эффективность и простота применения. Хотя электропереноса сегодня ген широко используется для трансфекции всех типов клеток и первый этап клинических испытаний с помощью этого метода было сообщено 4, основные механизмы до сих пор не ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана словенского агентства исследований (проект J2-9770, инфраструктурных IP-0510 центр и программы Р2-0249). Это видео представляет дополнительный материал для "Электропорация основе технологий и методов лечения" научно-практический семинар и аспирантуру, организованный факультет электротехники в университете Любляны, Словения. Авторы благодарят также DUSA Ходжич за любезно предоставленные плазмидной ДНК.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Название реагента Компания Номер в каталоге Комментарии
HAM-F12 ПАА E15-016 культуральной среде
L-глютамин Sigma-Aldrich G7513
эмбриональной телячьей сыворотки ПАА А15-151
гентамицин Sigma-Aldrich G1397 антибиотик
crystacilin Плива 625110 антибиотик
pEGFP-N1 Clontech лаборатории 6085-1 ДНК плазмиды
HiSpeed ​​плазмиды Комплект Maxi Qiagen 12662
Na 2 HPO 4 Merck F640786 933
NaH 2 PO 4 ИТК Храстник 0795
MgCl 2 Sigma-Aldrich M-8266
сахарозы Sigma-Aldrich 16104
трипсин / ЭДТА решение Sigma-Aldrich T4174
пипетки На заказ
электрический генератор импульсов На заказ
6 лунками ТЭС 92406
15 мл центрифужную пробирку ТЭС 91015
75 см 2 культуру колбу ТЭС 90076

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rebersek, M. Electroporator with automatic change of electric field direction improves gene electrotransfer in-vitro. Biomed Eng Online. 6, 25-25 (2007).
  2. Trontelj, K., Rebersek, M., Miklavcic, D. Tip electrode chamber for small volume electroporation, electrofusion, and gene transfection. 18, (2006).
  3. Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO J. 1, 841-841 (1982).
  4. Daud, A. Phase I trial of interleukin-12 plasmid electroporation in patients with metastatic melanoma. J Clin Oncol. 26, 5896-5903 (2008).
  5. Pavlin, M., Miklavcic, D. Effective conductivity of a suspension of permeabilized cells: a theoretical analysis. Biophys J. 85, 719-729 (2003).
  6. Xie, T., Sun, L., Zhao, H., Fuchs, J., Tsong, T. Study of mechanisms of electric field-induced DNA transfection. IV. Effects of DNA topology on cell uptake and transfection efficiency. Biophys J. 63, 1026-1031 (1992).
  7. Rols, M., Delteil, C., Serin, G., Teissie, J. Temperature effects on electrotransfection of mammalian cells. Nucleic Acids Res. 22, 540-540 (1994).
  8. Golzio, M., Teissie, J., Rols, M. Cell synchronization effect on mammalian cell permeabilization and gene delivery by electric field. Biochim Biophys Acta. 1563, 23-28 (2002).
  9. Haberl, S., Miklavcic, D., Pavlin, M. Effect of Mg ions on efficiency of gene electrotransfer and on cell electropermeabilization. Bioelectrochemistry. 79, 265-271 (2010).
  10. Rols, M., Teissie, J. Electropermeabilization of mammalian cells to macromolecules: control by pulse duration. Biophys J. 75, 1415-1423 (1998).
  11. Kanduser, M., Miklavcic, D., Pavlin, M. Mechanisms involved in gene electrotransfer using high-and low-voltage pulses-An in vitro study. Bioelectrochemistry. 74, 265-271 (2009).
  12. Pavlin, M., Flisar, K., Kanduser, M. The role of electrophoresis in gene electrotransfer. J Membr Biol. 236, 75-79 (2010).
  13. Sersa, G., Cemazar, M., Semrov, D., Miklavcic, D. Changing electrode orientation improves the efficacy of electrochemotherapy of solid tumors in mice. Bioelectrochem Bioenerg. 39, 61-66 (1996).
  14. Faurie, C. Electro-mediated gene transfer and expression are controlled by the life-time of DNA/membrane complex formation. J Gene Med. 12, 117-125 (2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

GFP

Похожие статьи