Мы опишем альтернативный подход к перечислению микобактерий В пробирке, Который использует репортер-гена меткой микобактерий вместо колониеобразующих единиц (КОЕ). "Выживание" организмов, а в качестве принимающей ответ-маркеров измеряются одновременно, обеспечивая недорогой, универсальный и функциональная система для исследования хост / патогена взаимодействия в контексте туберкулеза.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Функциональные Всего Пробирная крови для измерения жизнеспособности микобактерий, используя Репортер-Gene меткой БЦЖ или M. Tb (БЦЖ Люкс / М. Tb Люкс)
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Функциональные тесты давно играют ключевую роль в измерении иммуногенности конкретной вакцины. Традиционно это выражается в виде титров бактерицидной активности сыворотки. Исследования титров бактерицидной активности сыворотки в ответ на детские вакцины позволили разработать и подтвердить пороговые значения для защитных иммунных ответов, и такие пороги используются в повседневной практике. Подобные тесты не были внедрены в рутинную оценку вакцин, которые индуцируют преимущественно клеточный иммунитет в форме эффекторных Т-клеточных ответов, таких как вакцины против туберкулеза. В моделях на животных эффективность конкретного кандидата в вакцины регулярно оценивается с помощью стандартизированных бактерицидных тестов, и все современные новые кандидаты в вакцины против туберкулеза проходили этот этап оценки перед началом 1-й фазы клинических испытаний на людях. Оценка иммуногенности и, следовательно, вероятности защитной эффективности новых противотуберкулезных вакцин в настоящее время в идеале должна проходить аналогичную поэтапную проверку на моделях человека, включая измерения в бактерицидных тестах.
Бактерицидные анализы в контексте исследований вакцин против туберкулеза уже хорошо зарекомендовали себя на животных моделях, где они применяются для скрининга потенциально перспективных кандидатов в вакцины. Снижение бактериальной нагрузки в различных органах служит основным показателем иммуногенности. Однако до настоящего времени подобные анализы не были внедрены в клинические исследования новых противотуберкулезных вакцин.
Несмотря на то, что точные механизмы, приводящие к гибели микобактерий внутри макрофагов человека, до сих пор остаются неясными, очевидно, что взаимодействие макрофагов и Т-клеток с микобактериями является необходимым. Анализ, описанный в данной работе, представляет собой новое поколение бактерицидных тестов, позволяющее изучать такие ключевые клеточные компоненты в присутствии всех остальных клеточных и гуморальных факторов цельной крови, не делая предположений об их относительном индивидуальном вкладе. Метод, разработанный нашей группой, использует малые объемы цельной крови и уже применялся в исследованиях взрослых и детей в регионах с эндемичным туберкулезом. Мы продемонстрировали иммуногенность вакцины БЦЖ, повышенный рост микобактерий у ВИЧ-положительных пациентов, а также влияние антиретровирусной терапии и витамина D на выживаемость микобактерий in vitro. Здесь мы обобщаем методологию и представляем данные о воспроизводимости этой относительно простой, недорогой и пригодной для использования в полевых условиях модели.
Примечание: Определения/сокращения
BCG lux = M. bovis BCG, Монреальский штамм, трансформированный шаттл-плазмидой pSMT1, содержащей гены luxAB из Vibrio harveyi под контролем микобактериального промотора GroEL (hsp60).
КОЕ = колониеобразующая единица (показатель жизнеспособности микобактерий).
Протокол
1. Подготовка БЦЖ люкс репортер микобактерий акции
- Расти БЦЖ люкс (М. Bovis БЦЖ штамма Монреаль трансформированных плазмидой трансфер pSMT1) при встряхивании на 200rpm до середины логарифмической фазы в Миддлбрук 7H9 бульона, содержащего 0,2% глицерина, 0,05% между 80 и 10% АЦП обогащения.
- Подготовка 1 мл разведения 1:10 культуры БЦЖ люкс в стерильном PBS в люминометра трубки (900μl + 100 мкл PBS БЦЖ люкс культуры) в двух экземплярах.
- Нагрузка трубку с N-децил альдегид (люциферазы субстрата фермента) на задней панели аппарата и обеспечить Крышка крепится и труб на месте.
- Премьер люминометра инжектора с подложкой через премьер программы, набор для введения 100 UCL х 3 в каждую из 3 пустых трубах грунтовки помещен в люминометра.
- Нагрузка 2 трубки в люминометра и снять показания с помощью программы установлена на уровне 100 инъекционных UCL субстрата в каждую пробирку и читать в течение 20 сек с интервалом 1 сек.
- Когда акция достигла 1x10 8 РГ / мл до 2х10 8 РГ / мл (это занимает около 3-4 дней роста), добавляют равный объем 30% стерильного глицерина, чтобы культура в 50 мл трубки сокола и осторожно перемешать.
- Алиготе 1,5 мл объема в подписанные 2 мл завинчивающейся крышкой микропробирок и хранить при температуре -80 ° C.
2. Определение фондовой РГ / КОЕ корреляции и содержание аликвоты
- Добавить 15 мл Миддлбрук культуральной среде 7H9 с 10% АЦП дополнение к 200 мл колбу с вентилируемый колпачок.
- Добавить 15μl из гигромицину и 30μl 20% Tween.
- Удалите флакон БЦЖ люкс из морозильника и размораживания при комнатной температуре (RT) в безопасности кабинета. Добавить содержимое флакона для средних и затяните крышку.
- Инкубируйте при встряхивании на 200rpm при температуре 37 ° С в течение 4 дней.
- На каждый день, составляют серийные 10-кратные разведения (1:10, 1:100, 1:1000, 1:10000 и 1:100000) для определения КОЕ.
- Настройка же разведений в параллельных и дублирующих определить люминесценции (см. часть 1,2-1,6).
- Приготовьте два 3-купе пластин Миддлбрук 7H11 агар (1 л жидкой среды, содержащей 0,5% глицерина, 10% OADC дополнения, 1 мл 20% Твин и 1 мл гигромицину).
- Пластина из 100 мкл каждого разведения на сегмент каждой пластины с использованием отдельных разбрасыватели, распределяя жидкость равномерно по отдельным камеры.
- Печать каждой пластины с парафильмом, помещают в стерильный пластиковый пакет, печать с автоклава ленты, и инкубировать при температуре 37 ° С в течение 2 недель с крышками вниз.
- Осмотрите регулярно до CFUs появляются (2-3 недели).
- Для подсчета колоний, удаления пластины из инкубатора и место на колонию счетчика. Рассчитать означает для каждого разведения от дубликатов пластин.
- Рассчитать РГ / КОЕ соотношение использованием эквивалентной РОС и КОЕ считается для каждого разведения. Отношение должно быть между 3 и 5 РГ / КОЕ.
3. Подготовка культуры БЦЖ люкс для прививки в цельной крови
- Добавить 15 мл Миддлбрук культуральной среде 7H9 с 10% АЦП дополнение к 200 мл колбу с вентилируемый колпачок.
- Добавить 15μl из гигромицину и 30μl 20% Tween.
- Удалите флакон БЦЖ люкс из морозильника и размораживания при комнатной температуре в безопасности кабинета. Добавить содержимое флакона для средних и затяните крышку.
- Инкубируйте при встряхивании на 200rpm при температуре 37 ° С в течение 2 до 4 дней.
- Подготовка 1 мл разведения 1:10 культуры БЦЖ люкс в стерильном PBS в люминометра трубки (900μl + 100 мкл PBS БЦЖ люкс культуры) в двух экземплярах.
- Премьер люминометра с субстратом (как описано выше), мягко вихревой трубы 2 и загрузить в люминометра и снять показания (как описано выше).
- Используйте это чтение для разбавления вниз культуры в ФБР, чтобы дать эквивалент 7х10 6 RLU (это даст посевной около 2х10 5 КОЕ / мл крови и отношение БЦЖ для моноцитов около 1:1, предполагая, что количество моноцитов около 2х10 5 до 4х10 5 моноциты на мл крови).
4. Подготовка цельной крови
- Возьмите 3 до 5 мл венозной крови в пробирку без консервантов гепарина.
- Передача крови 50 мл трубки сокола и разбавить равным объемом RPMI 1640, содержащей 25 мМ глютамина и HEPES (без ручки / стрептококк).
- Алиготе 900μl разведенной крови в трех экземплярах в стерильные пробирки, украшения для каждого момента времени (6 труб в общем объеме. 3 для 0hrs и 3 для 96hrs Настройка дополнительных труб для дополнительного timepoints, если это необходимо.
- Алиготе 900μl из Middlebrooks 7H9 культуральной среде с 10% АЦП + дополнение 50μg/ml гигромицину (той же среде, как использовать для культуры БЦЖ люкс) в двух экземплярах для роста контроля.
- Добавить 100 мкл разбавленного БЦЖ люкс в каждую пробирку крови, а также для контроля роста 2труб.
- Хорошо перемешайте и положите 3 bijous за 96 час временной точке и 2 управляет ростом на их стороне в качалке инкубаторе при температуре 37 ° C, 20 об / мин (CO 2 не требуется).
5. Измерение люминесценции (в 0hr и 96hrs)
- Центрифуга 3 bijous на 2000g в течение 10 мин.
- Осторожно выньте 300 мкл супернатанта, не нарушая гранул и место в 2 мл завинчивающейся крышкой микропробирок заморозить при -80 ° C для последующего анализа цитокинов.
- Добавить 300 мкл ФСБ каждого украшения, чтобы заменить объема супернатант удаляют.
- Аспирацию содержимого каждого украшения в соответствующие 50мл трубки сокола и добавить 8 мл дистиллированной воды в каждую пробирку. Начните таймер на 10 мин.
Nb: Это срочных шаг, и это инкубационный не должно быть длиннее 10 минут, начиная с момента, когда первые клетки вступают в контакт с водой. - Промыть каждую украшения с 2 мл дистиллированной воды и вихрь в течение 5 секунд до переломного в соответствующую трубку сокола.
- В конце 10-минутной инкубации, центрифуги сокола труб при 2000g в течение 10 минут.
- Декантировать супернатант в дезинфицирующий Surfanios.
- Добавьте несколько стеклянных шариков, чтобы каждая гранула и вихря.
- Добавить 1 мл стерильной PBS в каждую пробирку и вихря.
- В люминометра трубы, сделать разведение 1:10 для каждого образца в двух экземплярах с PBS (PBS 900μl + 100 мкл образца) и на 96 час временной точке. Сделайте то же разведениях для каждого из роста контроля.
- Аккуратно вихревой трубы и загрузить в люминометра и снять показания (как описано выше)
Nb: Чтения между трем образцам того же образца должна быть в пределах 15% друг от друга.
6. Представитель результаты:
Важно использовать бактерий в логарифмической фазе роста для цельной крови люкс анализы, то есть выросла за 48-72 часа до посева проб, а метаболической активности является субоптимальным, если либо прямо из морозильника или в стационарной фазе. До роста должны быть стандартизированы для серии экспериментов либо 48 или 72 часа, чтобы избежать изменчивости. На рисунке 1 показана кривая роста представителя культуры БЦЖ люкс. Время удвоения составляет около 24 часов, пока стационарная фаза будет достигнута.
Рисунок 1. Представителю кривая роста БЦЖ люкс более 96 часов в 7H9 средних и соотношение РОС и КОЕ.
Хотя РГ значения всегда коррелирует с CFU, число РГ соответствует одному КОЕ может варьироваться в зависимости от состава, который является, почему это хорошая практика, чтобы использовать те же замороженные запасы всей серии экспериментов, чтобы гарантировать последовательное множественности заражения ( МВД).
Таблица 1 показывает пример сырья дата время посева (T 0) и в 96 часов. Рост соотношения рассчитываются по формуле T 96 / T 0, но и другие промежутки времени, конечно, могут быть измерены. Это, однако, не рекомендуется использовать культурами более 96 часов, так как значительная гибель клеток происходит.
Таблица 1. Пример исходных данных на момент прививки (T0) и на 96 часов (T96) и расчетные соотношения роста с 3 взрослых доноров.
В зависимости от наличия антиген-специфической памяти ответы и, возможно, нейтрофилов, рост соотношения варьироваться между отдельными людьми, как показано ниже на рисунке 2 в крови у детей с и без ВИЧ-инфекции. В среднем, маленькие дети имеют более высокие темпы роста соотношения, чем взрослые, туберкулиновой пробы (TST) + ве лиц имеют более низкий рост, чем отношения TST-ве лиц, а также ВИЧ-инфицированные пациенты имеют высокий коэффициент роста из-за дефицита CD4 Т-клеток населения, одним из ключевых посредников клеточного иммунного ответа на микобактерии.
Рисунок 2 Интер-доноров изменчивости:. Рост отношения T 0 по сравнению с 96 часов для набора пациентов, в зависимости от основного ВИЧ-статуса.
Воспроизводимость роста отношения в течение времени показано на рисунке 3, в которой обобщены результаты от 64 доноров крови в два раза за период в 12 месяцев и от одного донора крови неоднократно для контрольных экспериментов. Возможные причины изменчивости могут быть изменения в микобактериальные сенсибилизации или изменчивость в пределах уровней принимающих цитокинов, как это наблюдается во многих биопробы.
Рисунок 3. () Одноместный доноров по 12 раз за 12 месяцев. (Б) несколько (64) доноров по 2 раза более 12 мonths.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Бактерицидное анализов в контексте исследований проблемы туберкулеза, вакцина хорошо известны на животных моделях, где они применяются для отбора потенциально перспективных вакцин-кандидатов. Сокращение бактериальной нагрузки в различных функциях органов в качестве основной для чтения из иммуногенности.
Первое поколение человека бактерицидные тесты были разработаны с использованием макрофагов один, инфицированных M. туберкулезом. КОЕ служили главным считывание микобактериальные выжи...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Эта работа финансировалась личным стипендии из Wellcome Trust, чтобы Беате Kampmann (056608, GRO77273).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Реагент | Компания | Cat Нет | |
| БЦЖ люкс | Различный | н / | |
| Миддлбрук 7H11 агар | Becton Dickinson | 283810 | |
| Миддлбрук 7H9 бульон | BD Biosciences | 271 310 (500 г) | |
| Миддлбрук АЦП обогащения | BD Biosciences | 212352 | |
| Миддлбрук OADC дополнения | Becton Dickinson | 212240 | |
| Твин-80 | Sigma Aldrich | 274364 | |
| Глицерин | Sigma Aldrich | G5150 | |
| Гигромицину B | Roche | 10843555001 (20 мл) | |
| N-децил альдегид | Сигма | D7384-100G | |
| Этанол (> 99,7%) | VWR | 101077 | |
| Стерильные PBS | В Доме | н / | |
| RPMI-1640 с L-глютамин, 25 мМ HEPES | Сигма | R0883 | |
| Стерильной дистиллированной воде | В Доме | н / | |
| Оборудование | |||
| Труба люминометра (инъекционный порт обязательно) | Бертольд AutoLumat LB953 или однотрубные люминометра Сириус | ||
| Люминометр труб, 12 х 75 мм, без оправы пирекса | Corning от VWR | 99445-12 | |
| Колб Эрленмейера с вентилируемыми колпачками, стерильные поликарбоната 250 мл | Corning через Fisher Scientific | 2150329 | |
| BD Vacutainer сбору крови трубки (без консервантов гепарин) | BD | 367676 | |
| 50мл Сокол трубы, конические | BD | 352077 | |
| 7 мл Sterilin образца полипропиленовые трубы украшения | VWR | 99445-12 | |
| Sterilin универсальные контейнеры (30 мл) | Лабораторный анализ ООО | 128C | |
| Стеклянные бусы диаметром 2 мм | SigmaAldrich | Z143928 | |
| 10 мл пипетки и пипетки мальчика | любой | ||
| 1000μl и 200 мкл пипетки и фильтр советы | любой | ||
| Общее лабораторное оборудование: | |||
| Класс II безопасности кабинета кабинет | |||
| Холодильник (4 ° С) | |||
| Центрифуга | |||
| Раскачивание шейкер платформа (180 0) смешать труб | |||
| Орбитальный Шейкер инкубатор установлена на уровне 37 ° С для посадки бактериальных культур |
Ссылки
- Cheng, S. H., Walker, L. Demonstration of increased anti-mycobacterial activity in peripheral blood monocytes after BCG vaccination in British school children. Clin Exp Immunol. 74, 20-205 (1988).
- Cheng, S. H., Walker, K. B. Monocyte antimycobacterial activity before and after Mycobacterium bovis BCG vaccination in Chingleput, India, and London, United Kingdom. Infect Immun. 61, 4501-4503 (1993).
- Silver, R. F., Li, Q. Expression of virulence of Mycobacterium tuberculosis within human monocytes: virulence correlates with intracellular growth and induction of tumor necrosis factor alpha but not with evasion of lymphocyte-dependent monocyte effector functions. Infect Immun. 66, 1190-1199 (1998).
- Hoft, D. F., Worku, S. Investigation of the relationships between immune-mediated inhibition of mycobacterial growth and other potential surrogate markers of protective Mycobacterium tuberculosis immunity. J Infect Dis. 186, 1448-1457 (2002).
- Worku, S., Hoft, D. F. Differential effects of control and antigen-specific T cells on intracellular mycobacterial growth. Infect Immun. 71, 1763-1773 (2003).
- Kampmann, B., Gaora, P. O. Evaluation of human antimycobacterial immunity using recombinant reporter mycobacteria. J Infect Dis. 182, 895-901 (2000).
- Cheon, S. H., Kampmann, B. Bactericidal activity in whole blood as a potential surrogate marker of immunity after vaccination against tuberculosis. Clin Diagn Lab Immunol. 9, 901-907 (2002).
- Janulionis, E., Sofer, C. Lack of activity of orally administered clofazimine against intracellular Mycobacterium tuberculosis in whole-blood culture. Antimicrob Agents Chemother. 48, 3133-3135 (2004).
- Kampmann, B., Tena, G. N. Novel human in vitro system for evaluating antimycobacterial vaccines. Infect Immun. 72, 6401-6407 (2004).
- Kampmann, B., Tena-Coki, G. N. Reconstitution of antimycobacterial immune responses in HIV-infected children receiving HAART. Aids. 20, 1011-1018 Forthcoming.
- Martineau, A. R., Wilkinson, R. J. A single dose of vitamin D enhances immunity to mycobacteria. Am J Respir Crit Care Med. 176, 208-213 (2007).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
