Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

Summary

Паразитоид (паразитарных) ос представляют собой основной класс естественных врагов многих насекомых, включая<em> DROSOPHILA MELANOGASTER</em>. Введем методы для распространения этих паразитов в<em> Drosophila</em> SPP. и продемонстрировать, как анализировать их влияние на иммунную ткани<em> Drosophila</em> Личинок.

Abstract

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. 1A-C), females of the genus Leptopilina (Fig. 1D, 1F, 1G) and Ganaspis (Fig. 1E) attack the larval stages. We use these parasites to study the molecular basis of a biological arms race. Parasitic wasps have tremendous value as biocontrol agents. Most of them carry virulence and other factors that modify host physiology and immunity. Analysis of Drosophila wasps is providing insights into how species-specific interactions shape the genetic structures of natural communities. These studies also serve as a model for understanding the hosts’ immune physiology and how coordinated immune reactions are thwarted by this class of parasites.

The larval/pupal cuticle serves as the first line of defense. The wasp ovipositor is a sharp needle-like structure that efficiently delivers eggs into the host hemocoel. Oviposition is followed by a wound healing reaction at the cuticle (Fig. 1C, arrowheads). Some wasps can insert two or more eggs into the same host, although the development of only one egg succeeds. Supernumerary eggs or developing larvae are eliminated by a process that is not yet understood. These wasps are therefore referred to as solitary parasitoids.

Depending on the fly strain and the wasp species, the wasp egg has one of two fates. It is either encapsulated, so that its development is blocked (host emerges; Fig. 2 left); or the wasp egg hatches, develops, molts, and grows into an adult (wasp emerges; Fig. 2 right). L. heterotoma is one of the best-studied species of Drosophila parasitic wasps. It is a “generalist,” which means that it can utilize most Drosophila species as hosts¹. L. heterotoma and L. victoriae are sister species and they produce virus-like particles that actively interfere with the encapsulation response². Unlike L. heterotoma, L. boulardi is a specialist parasite and the range of Drosophila species it utilizes is relatively limited¹. Strains of L. boulardi also produce virus-like particles³ although they differ significantly in their ability to succeed on D. melanogaster¹. Some of these L. boulardi strains are difficult to grow on D. melanogaster¹ as the fly host frequently succeeds in encapsulating their eggs. Thus, it is important to have the knowledge of both partners in specific experimental protocols.

In addition to barrier tissues (cuticle, gut and trachea), Drosophila larvae have systemic cellular and humoral immune responses that arise from functions of blood cells and the fat body, respectively. Oviposition by L. boulardi activates both immune arms^1,4. Blood cells are found in circulation, in sessile populations under the segmented cuticle, and in the lymph gland. The lymph gland is a small hematopoietic organ on the dorsal side of the larva. Clusters of hematopoietic cells, called lobes, are arranged segmentally in pairs along the dorsal vessel that runs along the anterior-posterior axis of the animal (Fig. 3A). The fat body is a large multifunctional organ (Fig. 3B). It secretes antimicrobial peptides in response to microbial and metazoan infections.

Wasp infection activates immune signaling (Fig. 4)⁴. At the cellular level, it triggers division and differentiation of blood cells. In self defense, aggregates and capsules develop in the hemocoel of infected animals (Fig. 5)^5,6. Activated blood cells migrate toward the wasp egg (or wasp larva) and begin to form a capsule around it (Fig. 5A-F). Some blood cells aggregate to form nodules (Fig. 5G-H). Careful analysis reveals that wasp infection induces the anterior-most lymph gland lobes to disperse at their peripheries (Fig. 6C, D).

We present representative data with Toll signal transduction pathway components Dorsal and Spätzle (Figs. 4,5,7), and its target Drosomycin (Fig. 6), to illustrate how specific changes in the lymph gland and hemocoel can be studied after wasp infection. The dissection protocols described here also yield the wasp eggs (or developing stages of wasps) from the host hemolymph (Fig. 8).

Protocol

Весь протокол эксперимента разделили на четыре этапа (рис. 9). (1) Культивирование осы на личинки мух (2) Установка инфекции и подготовка животных для вскрытия (3) изоляции и крепления хост / паразита структур; (4) Анализ иммунного тканей.

1. Культивирование Осы на личинки дрозофилы

Обеспечение оса культур требует тщательного планирования. По отношению к растущим мухи, это довольно трудоемкий. Мы поддерживаем наших колоний ос в лаборатории на личинки или куколки YW штамм дрозофилы при 24 ° C. Культивирование осы включает в себя сохранение постоянным источником хостов в нужном этапе и очистка "зараженных" флаконов мух, которые возникают перед осы делают. Осы следует haplodiploid метод определения пола и поэтому важно, что самки спариваются, прежде чем они заражают хозяев.

1. На 1-й день, добавьте небольшое прикосновение свежей предварительнопо сравнению дрожжей пасты (путем смешивания 1 мл воды примерно в 1 г сухих дрожжей в свежей пищи флакон лету рецепт лету пищи не является критической,. мы растем мухи на среду corn-meal/sucrose/agar. Место 50-60 молодых (2-4 дневных) взрослых YW (или другой по существу дикого типа штамма) летит, чтобы отложить яйца в течение 48 часов при температуре 24 ° C.
2. На 3-й день, удалить мух от ампул. Поместите шум разъем на флакон с каплей меда на внутреннюю сторону вилку гудение. Мед разбавляют 2:1 в дистиллированной воде.
3. Использование CO _2, обезболить осы и сортировать 6-8 самки и 6-8 самцов, примерно 2-3 дней. Добавьте их в пробирку, содержащую 0-48 час старых хозяев. Обратите внимание, что осы являются более чувствительными к CO _2, чем мухи, и вам придется калибровать их воздействия газа. Drosophila исследователи не используют стандартный наркоз Drosophila станции дизайн. Хорошая отправная точка, чтобы обезболить осы, ​​это установить давление CO ₂примерно половину того, что необходимо для обезболивающим мух.
4. Замените разъем шум (с медом) на флаконе. Аккуратно поместите флакон на его стороне, пока осы проснуться.
5. Поместите эти флаконы с личинками мух и ос в 24 ° C инкубатора.
6. Успешное инфекции приведет к задержке pupariation немного. Хосты, которые пострадали от нападения ос, но в состоянии защитить себя (или, если они не заражены), продолжить развитие в соответствии с нормальным графиком и взрослых мух выйти из этих пупарии задолго до ос.
7. В зависимости от вида осы и температуры, осы eclose в 25-30 дней.
8. Удалить взрослых мух из флакона, в котором осы развивается.

2. Настройка инфекции и зараженных животных Подготовка к Dissection

Прежде чем начать, есть несколько чистых стеклянных или пластиковых чашках Петри, Pyrex рассечения блюдо с 9 депрессии, Kimwipes, дистиллированная вода (в шприц бутылку), 70% этанола (в шприц бутылку), 1X PBS (в шприц бутылку), предметные стекла, и небольшой, чистый шпатель удобно.

1. Чтобы настроить инфекций, выполните шаги 1-5 выше. В зависимости от опыта, это может быть необходимо использовать узлы, которые находятся на примерно такой же стадии развития. Для этого egglays 2-6 часов может быть использован для заражения.
2. Для уборки инфицированных личинок (для вскрытия иммунной ткани или паразитов), удалите содержимое флакона лету в небольшой стеклянной или пластиковой чашке Петри.
3. Использование стереомикроскоп и тонкие щипцы (пинцет), тщательно подобрать 6-10 личинок, один за одним, и поместить их в депрессию и с 1X PBS, а затем передавать их в воду, 70% этилового спирта, воды и 1X PBS, подряд. Цель этих шагов, чтобы освободить животных лету пищи и тщательно очищать и стерилизовать их поверхности. Прополоскать в воде растворяются этанола и окончательной промывки в PBS удаляет этанола. В шаге 3 ниже, то лучше не оставлятьживотных в PBS в течение более 10 минут.

3. Изоляции и крепления Host / паразита структур

Фон

Личиночной лимфатические небольшой гемопоэтических ⁷ органа. На третьем личиночного возраста, лимфатические железы содержит большой парой передних долях, обрамляющих спинного сосуда (рис. 3, 6Б-C, 7А-D). Передние доли делятся на специализированные регионов с уникальными свойствами клетки ^7. Прародителей из трех типов клеток, плазматоциты, lamellocytes и кристально клетки находятся в передних долях. Перикарда клетки отделить переднюю доли от меньшего задней доли. Железы дрозофилы лимфатических является моделью для насекомых и млекопитающих кроветворения ^8,9.

Жир тела функционально похож на печени млекопитающих. Гуморального ответа срабатывает в жировых микробных следующий тела или оса инфекции ^1,4,10. КакВ результате уникального сочетания генов антимикробных пептида, активируются и пептидов, выделяемых в гемолимфе ^1. Жир также является основным ткани гликогена и триглицеридов производства и хранения ^11. Личиночной жира занимает значительный объем hemocoel и, таким образом, в отличие от лимфатических желез, легко найти. Покажем теперь, как анализировать лимфатические и жир с третьего возраста личинок.

Перед тем как начать

Нужна тонкая щипцы (пинцет) и этанола очисткой слайды микроскопом.

Личинок вскрытие лимфатические

1. Используя тонкий пинцет, выберите блуждающих третьей взрослой личинки хранятся в 1X PBS.
2. Установите личинку на предметное стекло микроскопа.
3. Используя щипцы, расположить животное с брюшной стороной вверх.
4. С помощью двух пар щипцы, держать животное по бокам заднего конца (стрелки 1, рис. 3А) и гвидимому тянуть кутикулы ввести небольшой поверхностный разрыв в кутикулу.
5. Гемолимфы содержащие гемоциты, кишечнике, и жир начинает бежать из полости тела. Гемолимфы может быть принято с 10 мкл "pipetteman", чтобы сделать мазки, если это необходимо.
6. Размещение и пинцетом с правой стороны животного под рот крючки (стрелки 2, рис. 3A), аккуратно разорвать кутикулы.
7. Перемещение и щипцы в левую сторону животного под рот крючки (стрелки 2, рис. 3А) и аккуратно сделать еще один небольшой разрыв.
8. Держа рот крючки животных, осторожно потяните вниз кутикулы к заднему концу животного (как будто пилинг его обратно).
9. Как кутикула отстранился, мозга, жира, имагинальные диски, слюнных желез, и железистого будет подвергаться. Отдельные кутикулы сейчас находится на заднем конце, но все равно придется спинной сосуд с лимфатических узлов прилагается к нему. </ LI>
10. Разрежьте преджелудков и переместите его подальше от области лимфатические. Лимфатических узлов будет под мозга, даже если вы не сможете его увидеть.
11. Тщательно дразнить от жира, кишечник, слюнные железы, а также других структур, которые могут сидеть на железе. Будьте осторожны, чтобы не отделить лимфатических узлов из железа кольцо и спинного сосуда расположены позади мозга. Лимфатических узлов будут расположены плоско по отношению к предметное стекло микроскопа.
12. Осторожно удалите все дополнительные тканей от лимфатических желез, пока вся железа разворачивается из передней доли в окончательный набор перикарда клеток.

Примечание: правильно расчлененный лимфатических узлов будет иметь одну пару передних долей и два комплекта задних долей вдоль спинного сосуда (рис. 6Б). Доли могут быть легко повреждены или может отвалиться от спинного сосуда. Образцы Поэтому следует с большой осторожностью. Железы и чкак тенденцию высыхать или договором. Осторожно расправляя орган на своем заднем конце учитывает все детали и клетки, которые будут представлены хорошо. Это особенно необходимо для иммунной протоколов.

Фэй тело вскрытия

1. На вскрытии этапе Zeiss 1000 рассечения микроскопа (любой стерео рассечения микроскоп может быть использован), разместить световой короб, который позволяет падающего света должны быть переданы через образец. Поместите 1/3 взрослой личинки с шага 2 на предметном стекле микроскопа в 200 мкл 1X PBS. Наклоните источник света от образца, так что организм появляется прозрачное, и поэтому легко представить себе его внутренних органов.
2. Используя щипцы, положение животного так, чтобы передний конец от вас.
3. Используя щипцы, держать кутикулу личинки на левой стороне ее крючки во рту (стрелка 1, рис. 3B). Использование других щипцы, мягко разорвать кутикулы на всем пути к заднему концу (агrowhead 2, рис 3B). Не рвать кутикулу от тела на заднем конце.
4. Очень осторожно начать удаление кишки в одну сторону.
5. Аккуратно снимите головной мозг, имагинальные диски и кольца железы лимфатических узлов проходит через спинной сосуд.
6. Не снимайте слюнных желез, так как есть жир соблюдение этих желез.
7. Аккуратно удалите кутикулу и оставить жира на слайде в 1X PBS.

Примечание 1: жир имеет только один слой клеток, и поэтому важно, чтобы все плоские клетки в одной плоскости на стекле. Клетки endopolyploid и легко визуализировать. Хорошо расчлененный жира образцы должны поддерживать нормальные контакты клетки, и должны иметь минимальный жировых шариков вокруг расчлененный образца (рис. 6I, J).

Примечание 2: Если оса яйца остаются в силе в иммунной системе, они будут initiatразвитие электронной почти сразу. Ранние стадии развития паразита (от принимающей личинка) легко доступны с расчлененным hemocoel (рис. 8). Паразита яиц или личинок либо придерживаться жира или других органов, или просто поскользнуться на стекле во время вскрытия.

4. Анализ иммунного тканей

1. Воздух сухой лимфатических узлов в течение 5-10 мин и удалить 1X PBS от жира слайд тела до фиксации в течение 5-10 минут с 4% параформальдегид подготовлен в PBS. Каждый слайд может иметь несколько расчлененных лимфатических узлов для окрашивания. Перемещение слайда с фиксированной образцов в домашних влажной камере для последующих шагов. Эта камера готова к размещению два куска сложенной, влажные салфетки на дне пустой ящик микропипетки кончик пластика. Один или несколько слайдов с образцами могут быть размещены в верхней части делителя используется для проведения советов.
2. Таким образом, анализ иммунных тканей производится в соответствии со стандартными методами, которыесочетают в естественных условиях маркировки клеток и косвенные ⁴ иммуногистохимии.

5. Представитель Результаты

1. Wasp инфекции активирует экспрессию репортерного Toll путь Drosomycin-GFP (рис. 6G, J). В этом эксперименте, влияние ос-заражения на экспрессию генов визуализируется в естественных условиях использования GFP-репортера связано с промоутером доктора ^12. В неинфицированных контрольных животных, экспрессия GFP не обнаружено. Сигнал GFP явно обнаруживается в цитоплазме и ядре клетки жира, расчлененных животных, инфицированных L. victoriae. Для получения наилучших результатов, отношение ос: хосты должны быть 1:10. Инфекции должно длиться не менее 2 часов. Сообщение заражения, доктора-GFP сигнал усиливается и много жировых клеток тела GFP-положительных даже до 72 часов ^1,4.
2. Wasp инфекция вызывает дифференциация lamellocytes в лymph железы (рис. 6). Lamellocytes окружить и блокировать развитие оса (рис. 6H). Лимфатических желез расчлененный для визуализации клеточных изменений, вызванных в передних долях после L. victoriae инфекции. Новые дифференцированные lamellocytes присутствует на периферии расчлененный долями; lamellocytes отмечены GFP трансгена, который обусловлен деформированным усилителя (MSNF9-GFP). Все клетки визуализируются с использованием нитевидных актина родамин-меченого фаллоидином. Обратите внимание, что целостность передней долей нарушается в этих желез, как базальная мембрана, которая обычно окружает доля непрерывно (рис. 6), в настоящее время разрывные (рис. 6). Из того же вскрытия, lamellocytes в гемолимфе может быть визуализированы в мазках (рис. 6G), некоторые из которых связаны с капсулой структура, образованная, чтобы блокировать развитие паразита (рис. 6H).
3. Spätzle белка выражается в большинстве клеток личинок лимфатические (рис. 7, D). Для определения СЗЗ в расчлененных лимфатических узлов, мы следовали стандартным протоколом для окрашивания клеток в лимфатических желез с поликлональных анти-СЗЗ антител ^4. В естественных условиях, СЗЗ уровни увеличения в клетках лимфатических узлов после оса инфекции (сравните панелей Рис. 7С, E с 7G, я и панелей 7D, с F 7H, J).
4. Ранние и поздние стадии развития осы из личинок и куколок хост (рис. 8). Чтобы исследовать этапы развития ос, зараженные личинками расчлененных в различные моменты времени после откладки яиц. Здесь мы показываем, отбор проб из этих этапов из Leptopilina SPP. От инфицированных дикого типа D. MELANOGASTER хозяев.

<bт /> Рисунок 1. Различные виды ос и откладки яиц ос яйцо. Все изображения были получены с использованием стереомикроскопа Leica. Trichopria drosophilae женщина осы откладывают яйца в яйца D. MELANOGASTER куколки. B увеличение яйцекладки в Trichopria drosophilae в принимающих куколки. C Melanized пятна указывают на заживление ран на месте откладки яиц. D L. boulardi мужчины. E G. xanthopoda женщины. F L. victoriae женщины. G L. heterotoma мужчин (слева) и самка.

Рисунок 2. Жизненные циклы показывает мухи / осы гонки вооружений. Яйцекладки приводит к одному из двух результатов. Либо иммунной реакции удается блокировать развитие осы (слева), или осы подрывает иммунную Respo хозяинаNSES и успешно (справа). Изменения от Мельк и Говинда, 1999 ^18.

Рисунок 3. Третий личинки возраста показывает органов интерес до вскрытия. Все изображения были получены с использованием стереомикроскопа Leica. HML> GFP личинка с GFP (зеленый) флуоресценции (стрелка) в отдельных клетках лимфатических узлов указывает на общее расположение лимфатических узлов В интактных животных. Личинка, полученную с использованием флуоресценции и яркие оптика области. Стрелки указывают на местах важно для вскрытия лимфатических узлов протокол, описанный в тексте. В Кг> GFP личинка с GFP выражение в жировом теле, чтобы указать местоположение органа в здоровом анимдр.. Стрелки указывают на местах важно для жира протокол вскрытия тела описаны в тексте.

Рисунок 4. Иммуно-генетические схемы иммунного ответа против паразитных атаки. Основные компоненты звонок пути показаны. Spätzle (СЗЗ) активируется при обработке протеазы Spätzle фермент, SPE. Активированный СЗЗ выступает в качестве лигандов для Toll. Внутриклеточной сигнализации приводит к активации NF-kB транскрипционных факторов, Спинной и Диф. Кактус служит IκB ингибитор пути. Активация Drosomycin, канонический путь звонок целевого гена, можно контролировать с помощью трансгенных линий мух с корреспондентом GFP (см. рис. 6I, J).

Рисунок 5. Инкапсуляция в ответ на L. victoriae заражения вЗмей> GFP-дл Drosophila хозяев. Усилитель в змея ген экспрессируется в клетках крови ^13. При этом усилитель управляет выражением GFP-спинного гибридного белка в трансгенных, спинного обнаружен с помощью зеленой флуоресценции GFP в некоторых плазматоциты и lamellocytes, входящие в состав капсул и агрегатов. Все изображения были получены с использованием МНК Zeiss конфокальной микроскопии. Яйцо L. victoriae. BD Lamellocytes (белые стрелки), на заднем конце яйца экспресс-GFP-спинного. CD высшего увеличении образца в панели Б. Э. Образцы контрастным родамин-меченого фаллоидином визуализировать нитчатые актин (F-актин, красный) и Hoechst 33258 для визуализации ДНК (синий). E Encapsulated яйцо L. victoriae. F Melanized капсулы L. victoriae. GH L. victoriae инфеction побуждает клетки крови (plasmatocyte и lamellocyte) агрегации.

Рисунок 6. Иммунный ответ на инфекцию оса. Изображения в панели А и В были получены с использованием Сфера Zeiss Axio. Изображения на панелях CJ были получены с использованием МНК Zeiss конфокальной микроскопии. Хоста личинка показывает melanized инкапсулированные яйцо осы (стрелки) через прозрачную кутикулы. В Представитель третьего возраста личиночной лимфатические железы окрашенные Hoechst 33258 открывает клетки всех долей и перемежаются перикарда клеток. Шкала бар составляет 100 μ. CJ Все образцы были контрастно с Hoechst 33258 (на этикетке ядер) и родамина фаллоидином (для обозначения F-актин). CD Передняя лимфатических узлов доли от контроля (С) и Л. victoriae-инфицированных (D) MSNF9-GFP животных. В инфицированных животных, MSNF усилитель выражения, характерные для лаmellocytes ^14, обнаружен с ядерной репортера GFP. E Плазматоциты изолированы от незараженных животных не выразить GFP. Эти животные имеют очень мало, если вообще lamellocytes. F Плазматоциты (GFP-отрицательный, короткая стрелка) и вновь дифференцированной, более крупные lamellocytes (длинные стрелки) со слабыми ядерными выражения GFP из L. victoriae-инфицированных MSNF9-GFP личинки. G бесплатно и агрегированных плазматоциты и lamellocytes от hemocoel из L. victoriae-инфицированных доктора-GFP личинки. Выражение доктора-GFP репортер активируется в некоторых плазматоциты (короткая стрелка), но не в lamellocytes (длинные стрелки) после заражения. H инкапсулируются и личинка осы melanized из L. boulardi-инфицированных MSNF9-GFP хозяин личинки. Многочисленные MSNF9-GFP-положительных lamelloctyes окружают личинка осы (темно-структуры, толстая стрелка) и обладают сильным ядерным выражения GFP (длинные стрелки). Эта кастрюляЭль ранее опубликованной в PLoS One ^15. IJ клетки жира тела расчлененного от неинфицированных (I) и Л. victoriae-инфицированных (J), доктора-GFP личинки. GFP является ядра и цитоплазмы в жировых клетках тела зараженных животных. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Рисунок 7. Spätzle выражение после паразитных инфекций оса. AJ Образцы контрастным Hoechst 33258 для визуализации ДНК. Все изображения были получены с использованием МНК Zeiss конфокальной микроскопии. AF передней доли расчлененный из незараженных личинок YW. Образцы были обработаны для косвенного окрашивания без первичных антител (А и B) или с анти-СЗЗ антител (красный, C, D, E, F) и контрастным Alexa муки фаллоидином на этикетке F-актина в клетках (зеленые;. B, D, F) GJ передней доли расчлененный из зараженных личинками YW и окрашивали анти-СЗЗ антител (красный, G, H, I, J) и Alexa Fluor-фаллоидином (зеленый,. Панели H, J) EF высшего увеличениях образцов в C и D соответственно. IJ высшего увеличении образцов в G и Н соответственно. Масштаб баров в панели AD, G, H составляет 50 мкм.

Рисунок 8. Личинок и куколки Л. heterotoma и L. boulardi. отдельных этапах были изолированы от личиночной или куколки мухи заражения после хозяев, как указано. Все изображения были получены с использованием Сфера Zeiss Axio. Верхний ряд Ф. Л. heterotoma стадии 1-6 дней после заражения. Нижний ряд AF Постэмбриональное L. boulardi этапах, от 4 до 12 дней после заражения.

<img alt="Рисунок 9" sТс = "/ files/ftp_upload/3347/3347fig9.jpg" />
Рисунок 9. Схема экспериментальной протокола.

Discussion

Интерес к паразитической осы дрозофилы приливает в качестве молекулярных методов для расшифровки полного генома стать эффективным и рентабельным. Тем не менее, по сравнению с их исключительно хорошо изученных хозяев, много интересных аспектов осы биология остаются неясными. К ним относятся вопросы, связанные с проведение диапазона, подавление иммунитета, superparasitism и поведения. В центре внимания этой презентации было продемонстрировать воздействие инфекции на иммунный тканей мухи. Вскрытие методы показали здесь, может использоваться для анализа экспрессии генов на уровне РНК (в гибридизация), или для выделения нуклеиновых кислот для микрочипов или ПЦР, а также для западных анализа белков. Огромное разнообразие штаммов лету доступны со склада центров и отдельных исследовательских лабораторий, чтобы манипулировать и маркировать иммунных клеток. Выбор лету штаммов продиктовано экспериментальные вопросы. Эти методы вскрытия также может быть использована для анализа иммунныхтканей других видов дрозофилы.

Materials

Yeast	Fisher Scientific	S80245-3	Active Dry
Fly Food	Home made	Corn meal, sugar	Standard
Honey	Dutch Gold	From the store	Clover
Vials	Fisher Scientific	AS514
Cotton plug/Foam stopper	Fisher Scientific	14-127-40A
Spatula	Fisher Scientific	21-401-15
Pyrex dissecting dish	Fisher Scientific	50-930-382	9-well
Microscope slides pre-cleaned	Fisher Scientific	7101	25.4 mm x 76.2 mm
Glass coverslips	Pearl	D12544	22 x 50
Glass coverslips	Pearl	G12544	22 x 60
Pasteur Pipette	J H Berge	71-5200-05
100 mm Tweezers	Sigma-Aldrich	T-4662	Style # 5
Wash Bottle	Fisher Scientific	03-409-22A	Fisherbrand
Kim Wipess	Fisher Scientific	34155	Kimberly Clark
Paper Towel	Fisher Scientific	Fisher X-101-C	1/8 x 13 1/8 in.
Leica stereomicroscope	Empire Imaging Systems, INC.	10446208	MZFLIII
Zeiss Stereomicroscope	Carl Zeiss, Inc.	000000-1006-126	"Stemi" 1000 or 2000-C
Light Source -LED Gooseneck illuminator	Fisher Scientific	12563501
Stage	Carl Zeiss, Inc.
Zeiss Laser 510 Scanning Confocal Microscope	Carl Zeiss, Inc.
Incubator	Thermo Fisher Scientific, Inc.	815
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Salt Solution 1X	Fisher Scientific	MT-21-030-CM Mediatech
Ethanol	Fisher Scientific	64-17-5	99.5 %
Formaldehyde (37% w/w)	Fisher Scientific	F79-1
H–chst 33258	Molecular Probes, Life Technologies	H-1398	0.2 μg/ml Excitation 352 nm; Emission 461 nm
Rhodamine phalloidin	Molecular Probes, Life Technologies	R415	200 units/ml (6.6 μM) Excitation 546 nm; Emission 565 nm
Alexa Fluor 488 phalloidin	Molecular Probes, Life Technologies	A22289	Excitation 495 nm; Emission 518 nm 300 units/ml
CO<sub>2</sub> tank	TW Smith
Anti-Spz antibody	Gift Dr. C. Hashimoto (Yale)
Secondary antibody TRITC-conjugated donkey anti-rabbit, concentration 1:50.	Jackson ImmunoResearch	711-165-152	Detected at Excitation 546 nm; Emission 565 nm
Antifade	MP Biomedicals	ICN10274790	0.08 mg of N-propyl gallate in 20 ml of 50% glycerol in 1X PBS
<strong>Wasp Strains</strong>			<strong>Fly Strains</strong>
<em>L. victoriae</em><sup>16</sup>			<em>y w</em>
<em>L. boulardi 17</em><sup>1</sup>			<em>UAS-GFP-Dorsal</em><sup>17</sup>
<em>L. heterotoma</em><sup>2</sup>			<em>SerpentHemoGal4</em><sup>13</sup>
<em>L. heterotoma 14</em><sup>1</sup>			<em>MSNF9-moCherry</em><sup>14</sup>
<em>Trichopria drosophilae </em>			<em>MSNF-GFP</em><sup>15</sup>
<em>G. xanthopoda</em><sup>18</sup>			<em>y w Serpent-Gal4 UAS GFP-Dorsal/Basc</em><sup>4</sup>
<em>y w ; Drosomycin-GFP/CyO y+</em><sup>12</sup>