Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Введение в паразитических наездников

18.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/3347

⸱

7 мая 2012 г.

 ,  ,  , 
1Biology Department, The City College of New York, CUNY, 2The Graduate Center, The City University of New York

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Паразитоид (паразитарных) ос представляют собой основной класс естественных врагов многих насекомых, включая DROSOPHILA MELANOGASTER. Введем методы для распространения этих паразитов в Drosophila SPP. и продемонстрировать, как анализировать их влияние на иммунную ткани Drosophila Личинок.

Аннотация

Большинство известных видов ос-паразитоидов атакуют личиночные или куколочные стадии Drosophila. В то время как Trichopria drosophilae заражают хозяина на стадии куколки (Рис. 1A-C), самки родов Leptopilina (Рис. 1D, 1F, 1G) и Ganaspis (Рис. 1E) атакуют личиночные стадии. Мы используем этих паразитов для изучения молекулярных основ биологической «гонки вооружений». Паразитические осы обладают огромной ценностью в качестве агентов биоконтроля. Большинство из них несут факторы вирулентности и другие факторы, модифицирующие физиологию и иммунитет хозяина. Анализ ос, паразитирующих на Drosophila, позволяет понять, как видоспецифические взаимодействия формируют генетическую структуру природных сообществ. Эти исследования также служат моделью для изучения иммунной физиологии хозяев и того, как скоординированные иммунные реакции подавляются этим классом паразитов.

Кутикула личинки/куколки служит первой линией защиты. Яйцеклад осы представляет собой острую иглоподобную структуру, которая эффективно доставляет яйца в гемоцель хозяина. За откладкой яиц следует реакция заживления раны на кутикуле (Рис. 1C, стрелки). Некоторые осы могут отложить два или более яиц в одного хозяина, хотя успешно развивается только одно яйцо. Избыточные яйца или развивающиеся личинки удаляются в результате процесса, который до сих пор не изучен. Поэтому такие осы называются одиночными паразитоидами.

В зависимости от штамма мух и вида ос яйцо осы ожидает одна из двух судеб. Оно либо подвергается инкапсуляции, что блокирует его развитие (вылупляется хозяин; Рис. 2 слева); либо яйцо наездника вылупляется, развивается, линяет и превращается во взрослую особь (выход наездника; Рис. 2 справа). L. heterotoma является одним из наиболее изученных видов Drosophila паразитические осы. Это «генералист», что означает его способность использовать большинство Drosophila виды-хозяева1. L. heterotoma и L. victoriae являются сестринскими видами и продуцируют вирусоподобные частицы, которые активно подавляют реакцию инкапсуляции2В отличие от L. heterotoma, L. boulardi является специализированным паразитом, а диапазон Дрозофила количество используемых им видов относительно ограничено1Штаммы L. boulardii также продуцируют вирусоподобные частицы3 хотя они значительно различаются по своей способности к успешному прохождению D. melanogaster1Некоторые из этих L. boulardii штаммы трудно культивировать на D. melanogaster1 поскольку муха-хозяин часто успешно инкапсулирует их яйца. Таким образом, в конкретных экспериментальных протоколах важно иметь знания об обоих партнерах.

Помимо барьерных тканей (кутикулы, кишечника и трахеи), личинки Drosophila обладают системными клеточными и гуморальными иммунными ответами, которые обусловлены функциями клеток крови и жирового тела соответственно. Откладка яиц L. boulardi активирует оба звена иммунитета1,4. Клетки крови обнаруживаются в циркуляции, в виде неподвижных популяций под сегментированной кутикулой, а также в лимфальной железе. Лимфальная железа представляет собой небольшой гемопоэтический орган, расположенный на дорсальной стороне личинки. Скопления гемопоэтических клеток, называемые лопастями, расположены сегментарно парами вдоль дорсального сосуда, который проходит по передне-задней оси животного (Рис. 3A). Жировое тело является крупным многофункциональным органом (Рис. 3B). Оно секретирует антимикробные пептиды в ответ на микробные и метазойные инфекции.

Инфицирование осой активирует иммунный сигналинг (Рис. 4)4. На клеточном уровне это вызывает деление и дифференцировку клеток крови. В целях самозащиты в гемоцеле инфицированных животных развиваются агрегаты и капсулы (Рис. 5)5,6. Активированные клетки крови мигрируют к яйцу (или личинке) осы и начинают формировать вокруг него капсулу (Рис. 5A-F). Некоторые клетки крови агрегируют, образуя узелки (Рис. 5G-H). Тщательный анализ показывает, что инфицирование осой вызывает дисперсию периферических отделов самых передних долей лимфальной железы (Рис. 6C, D).

Мы представляем репрезентативные данные по компонентам сигнального пути Toll — Dorsal и Spätzle (Рис. 4, 5, 7), а также по его мишени Drosomycin (Рис. 6), чтобы проиллюстрировать, как можно изучать специфические изменения в лимфоидной железе и гемоцеле после заражения осами. Описанные здесь протоколы препарирования также позволяют выделить яйца ос (или развивающиеся стадии ос) из гемолимфы хозяина (Рис. 8).

Протокол

Весь протокол эксперимента разделили на четыре этапа (рис. 9). (1) Культивирование осы на личинки мух (2) Установка инфекции и подготовка животных для вскрытия (3) изоляции и крепления хост / паразита структур; (4) Анализ иммунного тканей.

1. Культивирование Осы на личинки дрозофилы

Обеспечение оса культур требует тщательного планирования. По отношению к растущим мухи, это довольно трудоемкий. Мы поддерживаем наших колоний ос в лаборатории на личинки или куколки YW штамм дрозофилы при 24 ° C. Культивирование осы включает в себя сохранение постоянным источником хостов в нужном этапе и очистка "зараженных" флаконов мух, которые возникают перед осы делают. Осы следует haplodiploid метод определения пола и поэтому важно, что самки спариваются, прежде чем они заражают хозяев.

  1. На 1-й день, добавьте небольшое прикосновение свежей предварительнопо сравнению дрожжей пасты (путем смешивания 1 мл воды примерно в 1 г сухих дрожжей в свежей пищи флакон лету рецепт лету пищи не является критической,. мы растем мухи на среду corn-meal/sucrose/agar. Место 50-60 молодых (2-4 дневных) взрослых YW (или другой по существу дикого типа штамма) летит, чтобы отложить яйца в течение 48 часов при температуре 24 ° C.
  2. На 3-й день, удалить мух от ампул. Поместите шум разъем на флакон с каплей меда на внутреннюю сторону вилку гудение. Мед разбавляют 2:1 в дистиллированной воде.
  3. Использование CO 2, обезболить осы и сортировать 6-8 самки и 6-8 самцов, примерно 2-3 дней. Добавьте их в пробирку, содержащую 0-48 час старых хозяев. Обратите внимание, что осы являются более чувствительными к CO 2, чем мухи, и вам придется калибровать их воздействия газа. Drosophila исследователи не используют стандартный наркоз Drosophila станции дизайн. Хорошая отправная точка, чтобы обезболить осы, ​​это установить давление CO 2примерно половину того, что необходимо для обезболивающим мух.
  4. Замените разъем шум (с медом) на флаконе. Аккуратно поместите флакон на его стороне, пока осы проснуться.
  5. Поместите эти флаконы с личинками мух и ос в 24 ° C инкубатора.
  6. Успешное инфекции приведет к задержке pupariation немного. Хосты, которые пострадали от нападения ос, но в состоянии защитить себя (или, если они не заражены), продолжить развитие в соответствии с нормальным графиком и взрослых мух выйти из этих пупарии задолго до ос.
  7. В зависимости от вида осы и температуры, осы eclose в 25-30 дней.
  8. Удалить взрослых мух из флакона, в котором осы развивается.

2. Настройка инфекции и зараженных животных Подготовка к Dissection

Прежде чем начать, есть несколько чистых стеклянных или пластиковых чашках Петри, Pyrex рассечения блюдо с 9 депрессии, Kimwipes, дистиллированная вода (в шприц бутылку), 70% этанола (в шприц бутылку), 1X PBS (в шприц бутылку), предметные стекла, и небольшой, чистый шпатель удобно.

  1. Чтобы настроить инфекций, выполните шаги 1-5 выше. В зависимости от опыта, это может быть необходимо использовать узлы, которые находятся на примерно такой же стадии развития. Для этого egglays 2-6 часов может быть использован для заражения.
  2. Для уборки инфицированных личинок (для вскрытия иммунной ткани или паразитов), удалите содержимое флакона лету в небольшой стеклянной или пластиковой чашке Петри.
  3. Использование стереомикроскоп и тонкие щипцы (пинцет), тщательно подобрать 6-10 личинок, один за одним, и поместить их в депрессию и с 1X PBS, а затем передавать их в воду, 70% этилового спирта, воды и 1X PBS, подряд. Цель этих шагов, чтобы освободить животных лету пищи и тщательно очищать и стерилизовать их поверхности. Прополоскать в воде растворяются этанола и окончательной промывки в PBS удаляет этанола. В шаге 3 ниже, то лучше не оставлятьживотных в PBS в течение более 10 минут.

3. Изоляции и крепления Host / паразита структур

Фон

Личиночной лимфатические небольшой гемопоэтических 7 органа. На третьем личиночного возраста, лимфатические железы содержит большой парой передних долях, обрамляющих спинного сосуда (рис. 3, 6Б-C, 7А-D). Передние доли делятся на специализированные регионов с уникальными свойствами клетки 7. Прародителей из трех типов клеток, плазматоциты, lamellocytes и кристально клетки находятся в передних долях. Перикарда клетки отделить переднюю доли от меньшего задней доли. Железы дрозофилы лимфатических является моделью для насекомых и млекопитающих кроветворения 8,9.

Жир тела функционально похож на печени млекопитающих. Гуморального ответа срабатывает в жировых микробных следующий тела или оса инфекции 1,4,10. КакВ результате уникального сочетания генов антимикробных пептида, активируются и пептидов, выделяемых в гемолимфе 1. Жир также является основным ткани гликогена и триглицеридов производства и хранения 11. Личиночной жира занимает значительный объем hemocoel и, таким образом, в отличие от лимфатических желез, легко найти. Покажем теперь, как анализировать лимфатические и жир с третьего возраста личинок.

Перед тем как начать

Нужна тонкая щипцы (пинцет) и этанола очисткой слайды микроскопом.

Личинок вскрытие лимфатические

  1. Используя тонкий пинцет, выберите блуждающих третьей взрослой личинки хранятся в 1X PBS.
  2. Установите личинку на предметное стекло микроскопа.
  3. Используя щипцы, расположить животное с брюшной стороной вверх.
  4. С помощью двух пар щипцы, держать животное по бокам заднего конца (стрелки 1, рис. 3А) и гвидимому тянуть кутикулы ввести небольшой поверхностный разрыв в кутикулу.
  5. Гемолимфы содержащие гемоциты, кишечнике, и жир начинает бежать из полости тела. Гемолимфы может быть принято с 10 мкл "pipetteman", чтобы сделать мазки, если это необходимо.
  6. Размещение и пинцетом с правой стороны животного под рот крючки (стрелки 2, рис. 3A), аккуратно разорвать кутикулы.
  7. Перемещение и щипцы в левую сторону животного под рот крючки (стрелки 2, рис. 3А) и аккуратно сделать еще один небольшой разрыв.
  8. Держа рот крючки животных, осторожно потяните вниз кутикулы к заднему концу животного (как будто пилинг его обратно).
  9. Как кутикула отстранился, мозга, жира, имагинальные диски, слюнных желез, и железистого будет подвергаться. Отдельные кутикулы сейчас находится на заднем конце, но все равно придется спинной сосуд с лимфатических узлов прилагается к нему.
  10. Разрежьте преджелудков и переместите его подальше от области лимфатические. Лимфатических узлов будет под мозга, даже если вы не сможете его увидеть.
  11. Тщательно дразнить от жира, кишечник, слюнные железы, а также других структур, которые могут сидеть на железе. Будьте осторожны, чтобы не отделить лимфатических узлов из железа кольцо и спинного сосуда расположены позади мозга. Лимфатических узлов будут расположены плоско по отношению к предметное стекло микроскопа.
  12. Осторожно удалите все дополнительные тканей от лимфатических желез, пока вся железа разворачивается из передней доли в окончательный набор перикарда клеток.

Примечание: правильно расчлененный лимфатических узлов будет иметь одну пару передних долей и два комплекта задних долей вдоль спинного сосуда (рис. 6Б). Доли могут быть легко повреждены или может отвалиться от спинного сосуда. Образцы Поэтому следует с большой осторожностью. Железы и чкак тенденцию высыхать или договором. Осторожно расправляя орган на своем заднем конце учитывает все детали и клетки, которые будут представлены хорошо. Это особенно необходимо для иммунной протоколов.

Фэй тело вскрытия

  1. На вскрытии этапе Zeiss 1000 рассечения микроскопа (любой стерео рассечения микроскоп может быть использован), разместить световой короб, который позволяет падающего света должны быть переданы через образец. Поместите 1/3 взрослой личинки с шага 2 на предметном стекле микроскопа в 200 мкл 1X PBS. Наклоните источник света от образца, так что организм появляется прозрачное, и поэтому легко представить себе его внутренних органов.
  2. Используя щипцы, положение животного так, чтобы передний конец от вас.
  3. Используя щипцы, держать кутикулу личинки на левой стороне ее крючки во рту (стрелка 1, рис. 3B). Использование других щипцы, мягко разорвать кутикулы на всем пути к заднему концу (агrowhead 2, рис 3B). Не рвать кутикулу от тела на заднем конце.
  4. Очень осторожно начать удаление кишки в одну сторону.
  5. Аккуратно снимите головной мозг, имагинальные диски и кольца железы лимфатических узлов проходит через спинной сосуд.
  6. Не снимайте слюнных желез, так как есть жир соблюдение этих желез.
  7. Аккуратно удалите кутикулу и оставить жира на слайде в 1X PBS.

Примечание 1: жир имеет только один слой клеток, и поэтому важно, чтобы все плоские клетки в одной плоскости на стекле. Клетки endopolyploid и легко визуализировать. Хорошо расчлененный жира образцы должны поддерживать нормальные контакты клетки, и должны иметь минимальный жировых шариков вокруг расчлененный образца (рис. 6I, J).

Примечание 2: Если оса яйца остаются в силе в иммунной системе, они будут initiatразвитие электронной почти сразу. Ранние стадии развития паразита (от принимающей личинка) легко доступны с расчлененным hemocoel (рис. 8). Паразита яиц или личинок либо придерживаться жира или других органов, или просто поскользнуться на стекле во время вскрытия.

4. Анализ иммунного тканей

  1. Воздух сухой лимфатических узлов в течение 5-10 мин и удалить 1X PBS от жира слайд тела до фиксации в течение 5-10 минут с 4% параформальдегид подготовлен в PBS. Каждый слайд может иметь несколько расчлененных лимфатических узлов для окрашивания. Перемещение слайда с фиксированной образцов в домашних влажной камере для последующих шагов. Эта камера готова к размещению два куска сложенной, влажные салфетки на дне пустой ящик микропипетки кончик пластика. Один или несколько слайдов с образцами могут быть размещены в верхней части делителя используется для проведения советов.
  2. Таким образом, анализ иммунных тканей производится в соответствии со стандартными методами, которыесочетают в естественных условиях маркировки клеток и косвенные 4 иммуногистохимии.

5. Представитель Результаты

  1. Wasp инфекции активирует экспрессию репортерного Toll путь Drosomycin-GFP (рис. 6G, J). В этом эксперименте, влияние ос-заражения на экспрессию генов визуализируется в естественных условиях использования GFP-репортера связано с промоутером доктора 12. В неинфицированных контрольных животных, экспрессия GFP не обнаружено. Сигнал GFP явно обнаруживается в цитоплазме и ядре клетки жира, расчлененных животных, инфицированных L. victoriae. Для получения наилучших результатов, отношение ос: хосты должны быть 1:10. Инфекции должно длиться не менее 2 часов. Сообщение заражения, доктора-GFP сигнал усиливается и много жировых клеток тела GFP-положительных даже до 72 часов 1,4.
  2. Wasp инфекция вызывает дифференциация lamellocytes в лymph железы (рис. 6). Lamellocytes окружить и блокировать развитие оса (рис. 6H). Лимфатических желез расчлененный для визуализации клеточных изменений, вызванных в передних долях после L. victoriae инфекции. Новые дифференцированные lamellocytes присутствует на периферии расчлененный долями; lamellocytes отмечены GFP трансгена, который обусловлен деформированным усилителя (MSNF9-GFP). Все клетки визуализируются с использованием нитевидных актина родамин-меченого фаллоидином. Обратите внимание, что целостность передней долей нарушается в этих желез, как базальная мембрана, которая обычно окружает доля непрерывно (рис. 6), в настоящее время разрывные (рис. 6). Из того же вскрытия, lamellocytes в гемолимфе может быть визуализированы в мазках (рис. 6G), некоторые из которых связаны с капсулой структура, образованная, чтобы блокировать развитие паразита (рис. 6H).
  3. Spätzle белка выражается в большинстве клеток личинок лимфатические (рис. 7, D). Для определения СЗЗ в расчлененных лимфатических узлов, мы следовали стандартным протоколом для окрашивания клеток в лимфатических желез с поликлональных анти-СЗЗ антител 4. В естественных условиях, СЗЗ уровни увеличения в клетках лимфатических узлов после оса инфекции (сравните панелей Рис. 7С, E с 7G, я и панелей 7D, с F 7H, J).
  4. Ранние и поздние стадии развития осы из личинок и куколок хост (рис. 8). Чтобы исследовать этапы развития ос, зараженные личинками расчлененных в различные моменты времени после откладки яиц. Здесь мы показываем, отбор проб из этих этапов из Leptopilina SPP. От инфицированных дикого типа D. MELANOGASTER хозяев.

Рисунок 1Рисунок 1. Различные виды ос и откладки яиц ос яйцо. Все изображения были получены с использованием стереомикроскопа Leica. Trichopria drosophilae женщина осы откладывают яйца в яйца D. MELANOGASTER куколки. B увеличение яйцекладки в Trichopria drosophilae в принимающих куколки. C Melanized пятна указывают на заживление ран на месте откладки яиц. D L. boulardi мужчины. E G. xanthopoda женщины. F L. victoriae женщины. G L. heterotoma мужчин (слева) и самка.

Рисунок 2
Рисунок 2. Жизненные циклы показывает мухи / осы гонки вооружений. Яйцекладки приводит к одному из двух результатов. Либо иммунной реакции удается блокировать развитие осы (слева), или осы подрывает иммунную Respo хозяинаNSES и успешно (справа). Изменения от Мельк и Говинда, 1999 18.

Рисунок 3
Рисунок 3. Третий личинки возраста показывает органов интерес до вскрытия. Все изображения были получены с использованием стереомикроскопа Leica. HML> GFP личинка с GFP (зеленый) флуоресценции (стрелка) в отдельных клетках лимфатических узлов указывает на общее расположение лимфатических узлов В интактных животных. Личинка, полученную с использованием флуоресценции и яркие оптика области. Стрелки указывают на местах важно для вскрытия лимфатических узлов протокол, описанный в тексте. В Кг> GFP личинка с GFP выражение в жировом теле, чтобы указать местоположение органа в здоровом анимдр.. Стрелки указывают на местах важно для жира протокол вскрытия тела описаны в тексте.

Рисунок 4
Рисунок 4. Иммуно-генетические схемы иммунного ответа против паразитных атаки. Основные компоненты звонок пути показаны. Spätzle (СЗЗ) активируется при обработке протеазы Spätzle фермент, SPE. Активированный СЗЗ выступает в качестве лигандов для Toll. Внутриклеточной сигнализации приводит к активации NF-kB транскрипционных факторов, Спинной и Диф. Кактус служит IκB ингибитор пути. Активация Drosomycin, канонический путь звонок целевого гена, можно контролировать с помощью трансгенных линий мух с корреспондентом GFP (см. рис. 6I, J).

Рисунок 5
Рисунок 5. Инкапсуляция в ответ на L. victoriae заражения вЗмей> GFP-дл Drosophila хозяев. Усилитель в змея ген экспрессируется в клетках крови 13. При этом усилитель управляет выражением GFP-спинного гибридного белка в трансгенных, спинного обнаружен с помощью зеленой флуоресценции GFP в некоторых плазматоциты и lamellocytes, входящие в состав капсул и агрегатов. Все изображения были получены с использованием МНК Zeiss конфокальной микроскопии. Яйцо L. victoriae. BD Lamellocytes (белые стрелки), на заднем конце яйца экспресс-GFP-спинного. CD высшего увеличении образца в панели Б. Э. Образцы контрастным родамин-меченого фаллоидином визуализировать нитчатые актин (F-актин, красный) и Hoechst 33258 для визуализации ДНК (синий). E Encapsulated яйцо L. victoriae. F Melanized капсулы L. victoriae. GH L. victoriae инфеction побуждает клетки крови (plasmatocyte и lamellocyte) агрегации.

Рисунок 6
Рисунок 6. Иммунный ответ на инфекцию оса. Изображения в панели А и В были получены с использованием Сфера Zeiss Axio. Изображения на панелях CJ были получены с использованием МНК Zeiss конфокальной микроскопии. Хоста личинка показывает melanized инкапсулированные яйцо осы (стрелки) через прозрачную кутикулы. В Представитель третьего возраста личиночной лимфатические железы окрашенные Hoechst 33258 открывает клетки всех долей и перемежаются перикарда клеток. Шкала бар составляет 100 μ. CJ Все образцы были контрастно с Hoechst 33258 (на этикетке ядер) и родамина фаллоидином (для обозначения F-актин). CD Передняя лимфатических узлов доли от контроля (С) и Л. victoriae-инфицированных (D) MSNF9-GFP животных. В инфицированных животных, MSNF усилитель выражения, характерные для лаmellocytes 14, обнаружен с ядерной репортера GFP. E Плазматоциты изолированы от незараженных животных не выразить GFP. Эти животные имеют очень мало, если вообще lamellocytes. F Плазматоциты (GFP-отрицательный, короткая стрелка) и вновь дифференцированной, более крупные lamellocytes (длинные стрелки) со слабыми ядерными выражения GFP из L. victoriae-инфицированных MSNF9-GFP личинки. G бесплатно и агрегированных плазматоциты и lamellocytes от hemocoel из L. victoriae-инфицированных доктора-GFP личинки. Выражение доктора-GFP репортер активируется в некоторых плазматоциты (короткая стрелка), но не в lamellocytes (длинные стрелки) после заражения. H инкапсулируются и личинка осы melanized из L. boulardi-инфицированных MSNF9-GFP хозяин личинки. Многочисленные MSNF9-GFP-положительных lamelloctyes окружают личинка осы (темно-структуры, толстая стрелка) и обладают сильным ядерным выражения GFP (длинные стрелки). Эта кастрюляЭль ранее опубликованной в PLoS One 15. IJ клетки жира тела расчлененного от неинфицированных (I) и Л. victoriae-инфицированных (J), доктора-GFP личинки. GFP является ядра и цитоплазмы в жировых клетках тела зараженных животных. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Рисунок 7
Рисунок 7. Spätzle выражение после паразитных инфекций оса. AJ Образцы контрастным Hoechst 33258 для визуализации ДНК. Все изображения были получены с использованием МНК Zeiss конфокальной микроскопии. AF передней доли расчлененный из незараженных личинок YW. Образцы были обработаны для косвенного окрашивания без первичных антител (А и B) или с анти-СЗЗ антител (красный, C, D, E, F) и контрастным Alexa муки фаллоидином на этикетке F-актина в клетках (зеленые;. B, D, F) GJ передней доли расчлененный из зараженных личинками YW и окрашивали анти-СЗЗ антител (красный, G, H, I, J) и Alexa Fluor-фаллоидином (зеленый,. Панели H, J) EF высшего увеличениях образцов в C и D соответственно. IJ высшего увеличении образцов в G и Н соответственно. Масштаб баров в панели AD, G, H составляет 50 мкм.

Рисунок 8
Рисунок 8. Личинок и куколки Л. heterotoma и L. boulardi. отдельных этапах были изолированы от личиночной или куколки мухи заражения после хозяев, как указано. Все изображения были получены с использованием Сфера Zeiss Axio. Верхний ряд Ф. Л. heterotoma стадии 1-6 дней после заражения. Нижний ряд AF Постэмбриональное L. boulardi этапах, от 4 до 12 дней после заражения.

figure-protocol-9 Рисунок 9. Схема экспериментальной протокола.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Интерес к паразитической осы дрозофилы приливает в качестве молекулярных методов для расшифровки полного генома стать эффективным и рентабельным. Тем не менее, по сравнению с их исключительно хорошо изученных хозяев, много интересных аспектов осы биология остаются неясными. К ним относятся вопросы, связанные с проведение диапазона, подавление иммунитета, superparasitism и поведения. В центре внимания этой презентации было продемонстрировать воздействие инфекции на иммунный тканей мухи. Вскрытие методы показали ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Мы благодарим профессора Тодда Schlenke для Trichopria drosophilae, профессор Тони Ip для трансгенных линий мух, и профессор Карл Хасимото по борьбе с Spätzle антител. Мы выражаем благодарность настоящим и прошлым членам лаборатории за их вклад в эту презентацию. Эта работа была поддержана грантами следующее: из NIH (S06 GM08168, RISE 41399-009 и G12-RR03060), USDA (NRI / USDA CSREES 2006-03817 и 2009-35302-05277) и ОАО Нью-Йоркского университета.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Genesee Научно
Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Материалы Тип Компания Номер в каталоге
Материалы для насекомых содержание культуры
Дрожжи Активные сухие Fisher Scientific S802453
Лети питание Кукурузная мука, сахар Стандартный рецепт
Мед Клевер Голландская Золото
Флаконы Полипропилен оболочка ампулы (узкий) Fisher Scientific AS514
Флакон закрытия Ватный тампон Fisher Scientific AS212
Флакон закрытия Buzz вилка AS273
Холодильные инкубатор Precision 815 Thermo Scientific 3721
Материалы для подготовки проб
CO 2 бака Кости сухие класса TW Smith UN1013
Шпатель Micro шпатель (14 см) Fisher Scientific 21-401-15
Pyrex пластин выборочная проверка 9-а вскрытии пластины 85 мм х 100 мм Томас Научно 7812G17
Пастера Пипетки Сода извести J & H Berge 71-5200-05
Щипцы Стиль # 5 Сигма T-4662
Этанол 190 доказательство USP Fisher Scientific 04-355-221
Формальдегид 37% / в Fisher Scientific F79-1
Вторичные антитела Cy3 AffiniPure осла анти-IgG кролика (H + L) 1:50 возбуждения 546 нм, 565 нм выбросов Джексон Иммуно Research Laboratories, Inc 711-165-152
Antifade (N-пропил галлат) 4 мкг / мл в 50% глицерина в 1X PBS MP Biomedicals 10274790
Глицерин Fisher Scientific G33-1
Hoechst 33258 0,2 мкг / мл возбуждения 352 нм, 461 нм выбросов Молекулярные зонды H-1398
Родамина фаллоидином 200 единиц / мл (6,6мкМ) возбуждения 540 нм, 565 нм выбросов Молекулярные зонды R415
Alexa Fluor 488 фаллоидином 300 единиц / мл возбуждения 495 нм, 518 нм выбросов Молекулярные зонды A12379
Одноразовые
Промойте бутылки Fisherbrand Fisher Scientific 03-409-22A
Kimwipes Kimberly Clark Fisher Scientific 06-666A
Бумажные полотенца 1-слойные C-Fold Птичье перо 901-7CFTB2400
Микроскопия ИNBSP;
Leica стереомикроскоп MZFLIII Империи Imaging Systems, Inc 10446208
Zeiss Стереомикроскоп Stemi 1000 или 2000-C Carl Zeiss 000000-1006-126
Источник света - LED Gooseneck осветитель Fisher Scientific 12563501
Этап Проходящий свет коробка с пластиной Carl Zeiss 455137000
Zeiss лазерной сканирующей конфокальной микроскопии LSM 510 Carl Zeiss
Zeiss сложный микроскоп Axioplan 2 вертикальных Carl Zeiss
Wasp Штаммы Лети Процедитьс
Leptopilina victoriae 16 YW
Leptopilina boulardi 17 1 UAS-GFP-спинного 17
Leptopilina heterotoma 2 SerpentHemoGal4 13
Leptopilina heterotoma 14 1 MSNF9-moCherry 14
Trichopria drosophilae MSNF-GFP 15
Ganaspis xanthopoda 18 YW Змей-Gal4 UAS GFP-Dorsal/Basc 4
YW; Drosomycin-GFP/CyO у + 12

Ссылки

  1. Schlenke, T. A., Morales, J., Govind, S., Clark, A. G. Contrasting infection strategies in generalist and specialist wasp parasitoids of Drosophila melanogaster. PLoS Pathog. 3, 1486-1501 (2007).
  2. Chiu, H., Morales, J., Govind, S. Identification and immuno-electron microscopy localization of p40, a protein component of immunosuppressive virus-like particles from Leptopilina heterotoma, a virulent parasitoid wasp of Drosophila. J. Gen. Virol. 87, 461-470 (2006).
  3. Gueguen, G., Rajwani, R., Paddibhatla, I., Morales, J., Govind, S. VLPs of Leptopilina boulardi share biogenesis and overall stellate morphology with VLPs of the heterotoma clade. Virus Res. 160, 159-165 (2011).
  4. Paddibhatla, I., Lee, M. J., Kalamarz, M. E., Ferrarese, R., Govind, S. Role for sumoylation in systemic inflammation and immune homeostasis in Drosophila larvae. PLoS Pathog. 6, e1001234(2010).
  5. Sorrentino, R. P., Carton, Y., Govind, S. Cellular immune response to parasite infection in the Drosophila lymph gland is developmentally regulated. Dev. Biol. , 243-265 (2002).
  6. Sorrentino, R. P., Melk, J. P., Govind, S. Genetic analysis of contributions of dorsal group and JAK-Stat92E pathway genes to larval hemocyte concentration and the egg encapsulation response in Drosophila. Genetics. 166, 1343-1356 (2004).
  7. Jung, S. H., Evans, C. J., Uemura, C., Banerjee, U. The Drosophila lymph gland as a developmental model of hematopoiesis. Development. 132, 2521-2533 (2005).
  8. Krzemien, J., Crozatier, M., Vincent, A. Ontogeny of the Drosophila larval hematopoietic organ, hemocyte homeostasis and the dedicated cellular immune response to parasitism. Int. J. Dev. Biol. 54, 1117-1125 (2010).
  9. Martinez-Agosto, J. A., Mikkola, H. K., Hartenstein, V., Banerjee, U. The hematopoietic stem cell and its niche: a comparative view. Genes Dev. 21, 3044-3060 (2007).
  10. Lemaitre, B., Hoffmann, J. The host defense of Drosophila melanogaster. Annu. Rev. Immunol. 25, 697-743 (2007).
  11. Schlegel, A., Stainier, D. Y. Lessons from "lower" organisms: what worms, flies, and zebrafish can teach us about human energy metabolism. PLoS Genet. 3, e199(2007).
  12. Ferrandon, D., Jung, A. C., Criqui, M., Lemaitre, B., Uttenweiler-Joseph, S., Michaut, L., Reichhart, J., Hoffmann, J. A. A drosomycin-GFP reporter transgene reveals a local immune response in Drosophila that is not dependent on the Toll pathway. EMBO J. 17, 1217-1227 (1998).
  13. Bruckner, K., Kockel, L., Duchek, P., Luque, C. M., Rorth, P., Perrimon, N. The PDGF/VEGF receptor controls blood cell survival in Drosophila. Dev. Cell. 7, 73-84 (2004).
  14. Tokusumi, T., Shoue, D. A., Tokusumi, Y., Stoller, J. R., Schulz, R. A. New hemocyte-specific enhancer-reporter transgenes for the analysis of hematopoiesis in Drosophila. Genesis. 47, 771-774 (2009).
  15. Tokusumi, T., Sorrentino, R. P., Russell, M., Ferrarese, R., Govind, S., Schulz, R. A. Characterization of a lamellocyte transcriptional enhancer located within the misshapen gene of Drosophila melanogaster. PLoS One. 4, e6429(2009).
  16. Morales, J., Chiu, H., Oo, T., Plaza, R., Hoskins, S., Govind, S. Biogenesis, structure, and immune-suppressive effects of virus-like particles of a Drosophila parasitoid, Leptopilina victoriae. J. Insect Physiol. 51, 181-195 (2005).
  17. Bettencourt, R., Asha, H., Dearolf, C., Ip, Y. T. Hemolymph-dependent and -independent responses in Drosophila immune tissue. J. Cell Biochem. 92, 849-863 (2004).
  18. Melk, J. P., Govind, S. Developmental analysis of Ganaspis xanthopoda, a larval parasitoid of Drosophila melanogaster. J. Exp. Biol. 202, 1885-1896 (1999).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Дрозофилы в качестве хозяевдиссекция лимфоидной железывыделение жирового теласодержание культуры осанализ иммунных тканейэкстракция гемолимфыметод отделения кутикулыфлуоресцентная микроскопияанализ экспрессии генов
Введение в паразитических наездников
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.