Комбинация лучевой терапии в Ортотопическая модель опухоли головного мозга мыши

Краткое содержание

Целью данной статьи является описание использования ортотопической модели глиобластомы для исследований химиолучевой терапии. В данной статье будут подробно рассмотрены процессы обработки клеток, имплантации и проведения лучевой терапии у мышей с использованием интракраниальной модели.

Аннотация

Глиобластома мультиформе (GBM) представляет собой наиболее распространенную и агрессивную первичную опухоль головного мозга у взрослых¹. В последние годы был достигнут значительный прогресс в понимании механизмов инвазии опухоли, а прямое внутримозговое введение опухолевых клеток дает возможность наблюдать инвазивный процесс в физиологически подходящей среде². Что касается опухолей головного мозга человека, доступные в настоящее время ортотопические модели создаются либо путем стереотаксической инъекции клеточных суспензий, либо путем имплантации целого фрагмента опухоли через сложную процедуру краниотомии³. В нашем методе мы собираем клетки из тканевой культуры для создания клеточной суспензии, которую затем имплантируют непосредственно в мозг. Продолжительность операции составляет примерно 30 минут, и поскольку мышь должна постоянно находиться в состоянии хирургического наркоза, используется инъекционный анестетик. Мышь помещают в стереотаксический прибор производства Stoetling (рисунок 1). После очистки и подготовки операционного поля делают надрез и находят брегма для определения места краниотомии. Точка краниотомии находится в 2 mm справа и в 1 mm ростральнее брегма. Глубина введения составляет 3 mm от поверхности черепа, клетки вводят со скоростью 2 μl каждые 2 минуты. Кожу зашивают нитью 5-0 PDS, и мыши дают проснуться на грелке. По нашему опыту, в зависимости от клеточной линии, лечение может быть начато через 7-10 дней после операции. Способ доставки препарата зависит от состава препарата. Для лучевой терапии мышей анестезируют и помещают в специально изготовленное приспособление. Тело мыши закрывают свинцовым экраном, оставляя открытым только мозг. Изучение туморогенеза и оценка новых методов терапии GBM требуют точных и воспроизводимых животных моделей опухолей мозга. Таким образом, мы используем данную ортотопическую модель мозга для изучения взаимодействия микроокружения мозга и опухоли, а также для проверки эффективности различных терапевтических агентов с применением облучения и без него.

Протокол

I. Подготовка клеток

1. Клетки выращивают до достижения конфлюэнтности в среде DMEM с 10% FBS; примерно один флакон объемом 225 cm³ с 80% конфлюэнтностью на каждые 5 мышей, предназначенных для имплантации.
2. Аспирируют среду с клеток; промывают 10 ml PBS без кальция и магния. Аспирируют PBS с клеток.
3. Клетки трипсинизируют, добавляя 3 ml трипсина, выдерживают 10-15 min, затем нейтрализуют трипсин 15 ml среды.
4. Все клетки вместе со средой переносят пипеткой в коническую пробирку объемом 50 ml. Содержимое двух больших флаконов помещается в одну пробирку объемом 50 ml.
5. Центрифугируют клетки при 1600 rpm в течение 7 min при 4 °C. Полностью аспирируют супернатант. Ресуспендируют клетки в 10 ml холодного PBS и промывают клетки, осторожно перемешивая содержимое пипеткой. Убедитесь, что клеточный осадок равномерно перемешан с PBS. Суспензия должна быть мутной.
6. На этом этапе проводят подсчет клеток с помощью счетчика Коултера. Клетки снова центрифугируют при 1600 rpm в течение 7 min при 4 °C.
7. После 2^го центрифугирования клеток аспирируют весь PBS и ресуспендируют клетки в 1 ml PBS.
8. Клетки в 1 ml PBS центрифугируют при 3000 rpm в течение 10 min при 4 °C. PBS аспирируют, затем добавляют PBS для доведения конечной концентрации до 1x10⁶ на 5 μl для клеток U87; для других клеточных линий может потребоваться иное количество и концентрация клеток для оптимального роста опухоли.
9. После достижения конечного объема и концентрации клетки хранят на льду в пробирке Эппендорфа.

II. Ксенотрансплантат

1. Подготовка мыши
   1. Мышам вводят анестетик — смесь кетамина, ксилазина и физиологического раствора. Состав смеси: 120 mg/kg кетамина, 16 mg/kg Rompun и физиологический раствор. Каждую мышь взвешивают индивидуально и вводят 0,1 ml на 10 g веса. Анестетик вводится внутрибрюшинно (IP) с помощью шприца объемом 1 ml с иглой 26G. Мыши достигают фазы глубокого сна с отсутствием болевой реакции примерно через 15 min. Болевой ответ можно проверить, сжав подушечку лапы.
   2. После полного погружения мыши в наркоз в глаза вводят глазную мазь, чтобы предотвратить их пересыхание.
   3. Мышь помещают на платформу стереотаксического прибора так, чтобы верхние передние резцы находились в выемке на ротовом фиксаторе. Затем платформу закрепляют в стереотаксе.
   4. На нос мыши устанавливают носовой фиксатор для предотвращения смещения головы, а в слуховые проходы осторожно вводят ушные стержни. Не следует затягивать носовой фиксатор или ушные стержни слишком сильно, так как это может привести к перелому черепа и/или нарушению дыхания у мыши.
   5. С помощью разметки на стереотаксе убедитесь, что голова мыши находится в горизонтальном положении.
   6. Для подготовки кожи головы мыши обильно и поочередно наносят спирт и раствор иодина (по 3 раза каждым средством). В завершение голову протирают тампоном с 70% спиртом.
2. Хирургическая процедура
   1. Все инструменты, используемые в процедуре, должны быть стерилизованы в автоклаве или путем замачивания в 70% этаноле перед началом работы.
   2. На верхней части черепа, за правым глазом, делают разрез по диагонали в сторону левой задней части черепа. Длина разреза должна составлять около 10 mm–15 mm.
   3. С помощью ватной палочки осторожно раздвигают края разреза, чтобы обнажить череп, и удаляют мембрану между черепом и кожей. Ватной палочкой промакивают кровь, контролируя отсутствие чрезмерного кровотечения.
   4. Обнажают верхнюю часть черепа для визуализации брегмы. С помощью кончика шприца Hamilton позиционируют его над брегмой. Правильное место для сверления отверстия в черепе находится на 2 mm справа и 1 mm спереди от брегмы (рисунок 2). Для разметки места будущего отверстия используют стерильный хирургический фломастер. Обратите внимание, что отверстие располагается близко к переднему шовному шву.
   5. Затем в отмеченном месте просверливают в черепе небольшое отверстие, используя кончик иглы 22G в держателе или иглу, пропущенную через иглу 18G.
   6. В стеклянный шприц Hamilton объемом 10 μl набирают 5 μl клеточной суспензии. Шприц Hamilton объемом 10 μl оснащен фиксированной тупой иглой 30G–33G. Перед набором обязательно перемешайте клетки путем пипетирования или с помощью шприца 1 ml с иглой 25G. После наполнения шприца Hamilton его возвращают в держатель, чтобы совместить с отверстием в черепе.
   7. Опускают тупой конец иглы к поверхности черепа; когда игла окажется на одном уровне с костью, ее погружают до глубины 3 mm под поверхность черепа.
   8. После погружения игла должна оставаться в этой позиции в течение 2 минут, чтобы избежать серьезного травмирования мозга. Имплантацию клеток проводят со скоростью 1 μl в минуту в течение 6–8 минут, следя за тем, чтобы не было обратного тока. После введения последних клеток иглу оставляют на месте еще на 2 минуты, чтобы все клетки осели.
   9. Иглу извлекают из мозга, а отверстие очищают ватной палочкой. Затем иглу и шприц промывают 50% ацетоном, 100% EtOH и PBS (по 3 раза в каждом растворе в указанном порядке).
   10. На данном этапе кожу на черепе можно зашить. С помощью нити 5-0 PBS разрез закрывают примерно 3 стежками.
   11. Мыши дают пробудиться на грелке, при необходимости повторно наносят глазную мазь. Мышь можно вернуть в клетку после появления самостоятельных движений (например, подъема головы или движения плечами).

III. Обработка имплантата IC радиационным и лекарственным воздействием

1. Лучевая терапия
   1. В зависимости от клеточной линии облучение мышей может быть проведено через 5–7 дней после имплантации. В нашем отделении для лучевой терапии используется установка для ортовольтажной лучевой терапии.
   2. Для визуализации опухоли перед рандомизацией могут быть использованы такие методы визуализации, как BLI (биолюминесцентная визуализация), МРТ или КТ (рисунок 3A).
   3. Мышей анестезируют коктейлем из кетамина/ксилазина/физраствора, как и ранее, и наносят глазную мазь на глаза.
   4. Мышей помещают в специально изготовленное устройство для облучения, имеющее форму колеса с секторами, в котором головы мышей направлены к центру. Тела мышей экранируют от радиации свинцом.
   5. Лекарственные препараты могут вводиться до или после облучения различными путями, например, подкожно (SQ), внутрибрюшинно (IP) или внутривенно (IV).

IV. Результаты

Мышь должна прийти в сознание после процедуры в течение 45–60 минут после введения анестетика. Если мышь с трудом пробуждается и с момента окончания процедуры прошло более 1½ ч, существует вероятность того, что животное не восстановится, и в таком случае эффективной альтернативой может стать эвтаназия. При возникновении чрезмерного кровотечения или трещин в черепе на любом этапе процедуры рекомендуется эвтаназия. При благоприятном течении процесса, в зависимости от клеточной линии, опухоль должна начать формироваться в течение 2–4 недель после проведения процедуры. При использовании моделей внутричерепного ксенографта терапевтическая эффективность обычно измеряется временем выживания после имплантации⁵. Однако, поскольку это модель внутричерепного процесса, признаки и симптомы появятся до наступления смерти. К физическим признакам, которые могут проявиться у мыши, относятся сгорбленная поза, потеря массы тела и малоподвижность. К неврологическим признакам могут относиться судороги, наклон головы и потеря равновесия. На рисунке 3B показано окрашивание опухоли гематоксилином и эозином (HE) на момент смерти. Для оценки данных используется график Каплана-Мейера (рисунок 4). Рассчитывается количество дней выживаемости для 50% группы и сравнивается с контролем. Если группа комбинированной терапии прожила дольше, чем при раздельном применении облучения и препарата, такая комбинация считается успешной.

Рисунок 1. Стереотаксическое оборудование Stoelting.

Рисунок 2. Схема расположения отверстия для трепанации в черепе мыши.

Рисунок 3A. BLI-визуализация после имплантации GBM.

Рисунок 3B. Окрашивание гематоксилином и эозином (H and E) опухоли ГБМ на момент смерти.

Рисунок 4. Результаты имплантации IC клеток U87 с введением ингибитора PARP через 7 дней после операции.

 

Обсуждение

Злокачественные глиомы, такие как мультиформная глиобластома, представляют собой наиболее распространенные первичные опухоли головного мозга и характеризуются неблагоприятным прогнозом⁴. Выживаемость пациентов с GBM оставалась практически неизменной в течение последнего десятилетия (т. е. 9–12 месяцев после постановки диагноза), несмотря на достижения в области хирургии, лучевой и химиотерапии⁵. Характеристики подходящей модели для изучения лечения глиомы должны включать воспроизводимую локализацию ...