Чтобы проследить прогрессирование иммунного ответа с течением времени в той же мыши, лимфатические узлы могут быть последовательно удалены хирургическим путем. Здесь мы опишем, как эта техника может быть выполнена.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Поверхностные мышей хирургии лимфатических узлов
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
В области иммунологии, чтобы понять, прогрессирование иммунного ответа на вакцину, инфекции или опухоли, ответ часто сопровождается с течением времени. Кроме того, исследование лимфоцитов гомеостаза требует экспериментов время курса. Выполнение этих работ в том же мышь идеально подходит для уменьшения экспериментальной изменчивости, а также количество мышей использовали. Забора крови позволяет проводить эксперименты время, конечно, но это только дает информацию о циркулирующих лимфоцитов и предоставляет ограниченное количество ячеек 1-4. Так как лимфоциты циркулируют по всему телу и проживающих в лимфатические узлы имеют различные свойства, важно изучить обоих местах. Последовательное удаление лимфатических узлов хирургическим путем предоставляет уникальную возможность следить за иммунный ответ или иммунной расширения ячейки в той же мыши с течением времени. Кроме того, этот метод дает от 1-2х10 6 клеток в лимфатических узлах, достаточное для пеrform фенотипические характеристики и / или функционального анализа. Последовательные операции лимфатических узлов или лимфаденэктомия была успешно использована нами и другими 5-11. Здесь мы опишем, как плечевой и паховые лимфатические узлы могут быть удалены, сделав небольшой разрез в коже anesthetised мыши. Поскольку операция является поверхностным и сделать быстро, мыши восстанавливается очень быстро, заживает хорошо и не испытывает чрезмерную боль. Каждый второй день, можно собрать один или два лимфатических узлов позволяет эксперименты время курса. Этот метод, таким образом, подходящим для изучения характеристик лимфатических узлов, проживающих лимфоцитов с течением времени. Такой подход годится для различных экспериментальных проектов и мы считаем, что многие лаборатории выиграют от выполнения последовательных операций лимфатических узлов.
Протокол
1. Подготовка перед операцией
Мыши были обработаны в соответствии с Канадским советом по руководящим принципам Animal Care.
- Anesthetise мышам инъекции кетамина / ксилазина (150/300 мг / кг, внутрибрюшинно) или при вдыхании ИФ (2%, 1 л кислорода). Если возможно, ИФ следует использовать, поскольку оно позволяет лучше контролировать анестезии времени и глубины. Кроме того, кислород вводится в то же время, поддерживает физиологические функции животных. Кроме того, ИФ непосредственно устранить легкие и, следовательно, не требует печени или почек метаболизм.
- Вводите бупренорфин (0,05 - 0,1 мг / кг, подкожно) или другой анальгетик.
- Применять мазь на глаза мыши до операции, чтобы избежать сухости глаз (если используется ИФ).
- Убедитесь, что мышь спит, зажимая лапой и подвижного хвоста. Если мышь не реагирует, приступить к операции.
2. Хирургия
- Поместите мышь на его стороне.
- Локализация региона, где вы будете выполнять incisioп., в зависимости от LN вы хотите собрать. (Рис. 1).
- Применение хлоргексидина или другого дезинфицирующего средства, в этом регионе.
- Сделать крошечный разрез с острыми ножницами (около 5 мм) или на задней части передней ноги или выше задней лапы у брюшной полости (рис. 1).
- Удалить волосы свободно вы сократили с щипцами. Если вы предпочитаете, вы можете брить мыши перед созданием разреза. Тем не менее, это удлиняет процедуру, и мы находим, что это не нужно, так, как показано ниже, это не улучшает заживление или уменьшение инфекции, которые являются очень редкими.
- Протяните разрез с 2 щипцы для того, чтобы увидеть LN. Разрез может достигать 10 мм. Л.Н. появляется сероватый или темнее, чем окружающие жира.
- Зажмите фасции (тонкие оболочки, покрывающей жир и ткани) в верхней части Л. с одним пинцетом и слегка потяните без нарушения окружающих тканей.
- Поместите второй щипцы, насколько это возможно недеформированнойrneath LN. С первым щипцы, сломать фасции и удаление LN. Если вы успешно собрали Л.Н., пятна крови должны находиться в месте, где LN ранее находились. Отметим, что Л. Н. тонет в изотонический раствор. Этот простой тест позволяет проверить, что вы извлекли Н., а не жировой ткани.
- Убедитесь, что не волосы в ране.
- Закройте разрез, придерживаясь 2 части кожи вместе (внутри кожи) и сшивания их клип. Мы используем несколько клипов Мишель с применением щипцов. Установите один или 2 ролика в зависимости от размера разреза. Чаще всего клипы упасть, когда ткань заживает.
3. Ведение послеоперационного периода
- Добавьте немного влажный корм на дно клетки мышей таким образом, может легко кормить после операции.
- Около 6 до 8 часов после операции, проверить мышей, чтобы они не испытывают боли. Внимательно наблюдать за их поведением (осанка, походка, ввзаимодействие с соединением и внешний вид меха). Если внешний вид мышей бедных, управлять второй дозы бупренорфина. На следующий день мыши должны восстановить их нормальное поведение в противном случае продолжить администрации бупренорфина. Мыши никогда не достигают конечных ранее определены и приняты Советом вашей помощи животных. Вы можете обратиться за советом и помощью к зоотехник виварий помощи.
4. Обработка лимфатических узлов
- В лабораторных условиях для получения суспензии отдельных клеток, отделить LN в соответствии с вашей обычной процедуре. Жмем Л.Н. против слайды матового и регулярно получать 1-2 × 10 6 клеток на LN. Кроме того, мы готовим LN для извлечения РНК.
- Пятно клеток в соответствии с вашим обычным протоколом. Вы должны получить ожидаемый Л.Н. профили проточной цитометрии.
5. Представитель Результаты
Например вперед и стороной разброс рМногое показано LNS собран из наркоза мыши хирургическим путем или пожертвовать мыши (рис. 2). Профиль и процент клеток в живых лимфоцитов ворот такие же, показывая, что Л.Н. хирургии соответствующую технику для уборки клетки.
Рисунок 1. Паховой и плечевой локализации LN в мышь. А. Н. паховой находится чуть выше задних лап, немного в сторону живота. В. Н. плечевой находится за передней ноги.
Рисунок 2. Проточная цитометрия профиля лимфоцитов, полученных после Л.Н. операции. Вперед и боковые профили разброс показаны для LNS найденным Anesthetized мыши хирургическим путем (A) или пожертвовать мыши (B). LNS были собраны, проанализированы и диссоциированных на проточной цитометрии. Процент клеток в живых лимфоцитов ворота показаны.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Мы описали протокол Л.Н. операции, которые могут применяться в отношении многих экспериментальных систем. Хотя очень полезно следовать иммунный ответ или иммунного гомеостаза клетки, этот метод имеет ряд ограничений. Во-первых, только четыре LNS могут быть собраны. Во-вторых, иммунный ответ должен быть изучен системным или происходят в поверхностных паховых или плечевой (кожа-слив) LNS. Наконец, число клеток, полученных зависит от качества Л.Н. удаления, технические ограничения, которые могут способствовать эксперимента...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Мы благодарим Сильви Лесаж и все лаборатории членов критического чтения протокола. Эта работа была поддержана грантом (СС-77 545) из Канадского института исследований в области здравоохранения (CIHR). Натали Labrecque поддерживается FRSQ старший стипендии и Мелисса Матье получил NSERC Александр Грэхем Белл Канада высшей стипендии.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Реагент Имя | Компания | Номер в каталоге | Комментарии |
| Грефе пинцет изобразительных премиум шаблон | Гарвардский аппарата | 52-2144 | Сильно изогнутый, 10 см (4 дюйма), 0,8 мм наконечником |
| Мишель клип Применение и удаление щипцы | Гарвардский аппарата | 52-3779 | 12,5 см (5 дюймов) |
| Мишель клипов 100 | Гарвардский аппарата | 52-3746 | 7.5-1.75 мм |
| Temgesic (бупренорфина гидрохлорид) | Schering-Plough | ||
| Vetalar (кетамина гидрохлорид) | Boniche животных здравоохранения | DIN: 01989529 | |
| Rompun (Ксилазин) | Bayer | DIN: 02169592 | |
| Изофлюран | ABBOTT | DIN: 02032384 | |
| Hypotears глазной мази | Novartis Ophtalmics | DIN: 02133288 | |
| Baxedin (Clorhexidine глюконат 2% изопропиловый спирт 70%) | Омега | L0000017 | DIN: 02251477 |
Ссылки
- Zehn, D., Lee, S. Y., Bevan, M. J. Complete but curtailed T-cell response to very low-affinity antigen. Nature. 458, 211-214 (2009).
- Vezys, V. Memory CD8 T-cell compartment grows in size with immunological experience. Nature. 457, 196-199 (2009).
- Zhou, X. Differentiation and persistence of memory CD8(+) T cells depend on T cell factor 1. Immunity. 33, 229-240 (2010).
- Wirth, T. C., Badovinac, V. P., Zhao, L., Dailey, M. O., Harty, J. T. Differentiation of central memory CD8 T cells is independent of CD62L-mediated trafficking to lymph nodes. J. Immunol. 182, 6195-6206 (2009).
- Rooke, R., Waltzinger, C., Benoist, C., Mathis, D. Targeted complementation of MHC class II deficiency by intrathymic delivery of recombinant adenoviruses. Immunity. 7, 123-134 (1997).
- Witherden, D. Tetracycline-controllable selection of CD4(+) T cells: half-life and survival signals in the absence of major histocompatibility complex class II molecules. J. Exp. Med. 191, 355-364 (2000).
- Labrecque, N. How much TCR does a T cell need. Immunity. 15, 71-82 (2001).
- Leignadier, J., Labrecque, N. Epitope density influences CD8+ memory T cell differentiation. PLoS One. 5, e13740(2010).
- Leignadier, J., Hardy, M. P., Cloutier, M., Rooney, J., Labrecque, N. Memory T-lymphocyte survival does not require T-cell receptor expression. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20440-20445 (2008).
- Obst, R., van Santen, H. M., Mathis, D., Benoist, C. Antigen persistence is required throughout the expansion phase of a CD4(+) T cell response. J. Exp. Med. 201, 1555-1565 (2005).
- Bassett, J. D. CD8+ T-cell expansion and maintenance after recombinant adenovirus immunization rely upon cooperation between hematopoietic and nonhematopoietic antigen-presenting cells. Blood. 117, 1146-1155 (2011).
- Lacombe, M. H., Hardy, M. P., Rooney, J., Labrecque, N. IL-7 receptor expression levels do not identify CD8+ memory T lymphocyte precursors following peptide immunization. J. Immunol. 175, 4400-4407 (2005).
- Leignadier, J., Rooney, J., Daudelin, J. F., Labrecque, N. Lowering TCR expression on naive CD8+ T cells does not affect memory T-cell differentiation. Immunol. Cell. Biol. 89, 322-325 (2011).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
