Количественные живой клетки флуоресцентной микроскопии Анализ деления дрожжевой

1. Деление культуры дрожжей

1. Подготовка Эдинбурге Минимальная Media (EMM) и EMM без ammoniumchloride (EMM-N) ^8. Для уменьшения флуоресценции раствора глюкозы не должны обрабатываться в автоклаве, но вместо этого фильтра стерилизовать использованием 0,2 мкм, а затем добавляется в автоклаве СМИ.
2. Привить деления клетки дрожжей свежих, выращенных на агар пластины с мультимедиа, YEA ^8, в 3 мл EMM жидких сред с фильтром стерилизовать глюкозы. Используйте 13mL труб с слегка толкнул на крышку, чтобы обеспечить хорошую вентиляцию клеток. Пусть клетки растут, встряхивая их с 225 оборотов в минуту в 30 ° C. Держите клеток, растущих в журнале фазы (1 Х 10 ⁶ - 2 х 10 ⁷ клеток / мл) в течение 2 дней, считая их с помощью камеры Burker следуют соответствующего разбавления, каждое утро и вечер.
3. В день эксперимента убедитесь, что клетки в ранней стадии журнал, 5 х 10 ⁶ - 1 х 10 ^{7 клеток} / мл.
4. Чтобы голодать тОн клеток для азота в течение 20 минут переключиться с EMM СМИ EMM-N СМИ. Это делается путем сбора урожая 3 мл клеток в 1,5 мл трубки Эппендорф в настольной центрифуге при максимальной 1,5 RCF как центрифугирование с более высокой скоростью может вызвать стрессовую реакцию деления дрожжевой ^9. Использование двойных технике вращения, то есть, сначала спина в течение 2 мин, затем повернуть трубку Eppendorf 180 ° и спина опять за 1,5 RCF 2 мин ^10. Это поможет собрать все клетки в одну крупинку в нижней части трубы. Промыть раз с EMM-N, а затем растворяются в гранулах EMM-N и инкубировать клетки в течение 15 минут при 30 ° С при 225 пожимая оборотов в минуту, а затем продолжить в точку 2. Подготовка образцов.

2. Пробоподготовка

1. Урожай 1,5 мл клеток в 1,5 мл Eppendorf трубки в настольный центрифуге при максимальной 1,5 RCF как центрифугирование с более высокой скоростью может вызвать стрессовую реакцию деления дрожжевой ^9. Использование двойных технике вращения meaniнг; первый спин в течение 2 мин, затем повернуть трубку Eppendorf 180 ° и спина опять за 1,5 RCF в течение 2 минут ^10. Это поможет собрать все клетки в одну крупинку в нижней части трубы.
2. Удалить супернатант, но оставить 10-15 мкл и ресуспендирования клеток в оставшихся средствах массовой информации. Кроме добавить 10 мкл свежей информации к ресуспендируют осадок клеток.
3. Убедитесь в том, чтобы ясно стеклянные и покровного стекла (не 1,5). Обычно вы не должны чистить их, но убедитесь, что они не полны пыли.
4. Выньте из морозильника аликвоту исходного раствора 1mg/mL лектин, который был фильтром стерилизовать. Лектин решение может быть замораживать несколько раз. Лектина используется для фиксации дрожжевых клеток на покровного стекла.
5. Место 5 мкл EMM с фильтром стерилизовать глюкозы на цели стекла.
6. Место 5 мкл лектина решение в углу покровного стекла. Впоследствии место 5 мкл клеточной культуре в том же углу, т.е. в лектин падение. Смешайте с помощью пипетки несколько раз, а затем распространилась культура клеток-лектин смесь всей покровного стекла с помощью длинной стороне кончика пипетки. В зависимости от плотности вашего мобильного смесь оставить все или поглощать избыток жидкости в противоположном углу покровного стекла.
7. Место покровного стекла, пополнить, с одной стороны, с целью стекла и другую сторону на скамейке запасных. Пусть покровного стекла подсушить в течение нескольких минут. Следует абсолютно не быть полностью сухой, но это не должно быть слишком много жидкости на стекло.
8. Место покровного стекла с приближенными 70 ° Ангел с целью стекла капли EMM. Отпусти покровного стекла так, что она упадет сверху вниз в каплю EMM.
9. Чтобы скрепить края с силиконовой смазки подготовить 2 мл шприц. Вырезать широком конце 200 мкл наконечник и прикрепите его к шприц. Заполните шприц с примерно 1 мл силиконовой смазки. Тонкая грань кремния наносится на края покровного стекла, аккуратно гнойасафетиды поршня шприца. Теперь у вас есть небольшая камера роста S. ротЬе клеток.

3. Микроскопия

1. Инициализации флуоресцентной микроскопии, включив ртути / ксеноновой лампы, микроскоп и компьютер. Место камере рост дрожжей в флуоресцентный микроскоп. Используйте 63 X объективным или 100 X объектива с NA = 1,3 или выше. Если нефть цели используется, добавьте масло.
2. Используйте яркие, чтобы найти клетки и получить четкое изображение.
3. Настройки для флуоресцентной микроскопии зависит от флуорохромов используется для обозначения дрожжевых клеток и микроскоп. Мы используем конфокальной микроскопии Zeiss LSM 700 лазерного сканирующего микроскопа с планом-Apochromat 63x объектив нефти (NA = 1,4) с 16-линия среднем настройки сканирования плоскости. Отверстие должно быть установлено в 1-1,1 Эйри единиц, что дает оптический срез 0,8 мм. Мы обнаружить GFP в Трек 1, используя набор фильтров для Alexa 488 с светоделитель на 582 нм, что гetecting длин волн между 488 и 582 нм. В Track 2 мы используем набор фильтров для оптимального использования mCherry светоделитель при 578 нм, что обнаружение длин волн между 578 и 600 нм. Это означает, что в обоих Трек 2 mRFP (СПБ) и Н. М. (mCherry) будут обнаружены.
4. Возьмите столько снимков, необходимо уметь измерять в 60 различных клеток для каждого штамма. Обычно 15 фотографий из независимых полей микроскопии достаточно. Рекомендуется, чтобы новые камеры роста со свежими клетками производится, если ваш микроскопии время превышает 60 минут.

4. Количественные измерения расстояний субклеточных

1. Откройте фото в программе Zeiss Zen издание Света. Использование мерой измерения расстояния инструмент в мкм между различными флуорохромами во всех клетках, где все сигналы находятся в одной фокальной плоскости. Отрегулируйте интенсивность света и контраста для определения центра флуоресцентного сигнала. Этот упрощенный протокол использует только две сolours и, следовательно, СПБ и Н. М. находятся в том же канале. SPB выделяется своими большими круглыми структуры в NM. Передача расстояния до блокнота листе. Мера, по крайней мере на 60 клеток. Другие программы, такие как ImageJ также может быть использован для измерения расстояния, но Zeiss Zen Свет является предпочтительным из-за его более высокое разрешение изображения и простоту для увеличения и с помощью этой программы. Картинки в формате LSM открыт в ImageJ будет иметь два канала друг на друга. Для того, чтобы изображение с обоих каналов, во-первых разделить два канала, а затем объединить их. После этого строки могут быть использованы для измерения расстояний, как описано выше.
2. Сравните среднее или среднее субклеточных расстояния между различными штаммами и процедур с использованием статистической программы, например, т-тест или Манна-Уитни ранг Сумма испытаний, например, с помощью SigmaStat-3.5 программного обеспечения. Часто данные не нормально распределенных так как не будет выбора для клеток с более короткимРасстояния между флуоресцентные сигналы, так как все сигналы должны быть в той же фокальной плоскости должны быть измерены. Т-тест может быть использован только, когда данные нормального распределения в то время как Манна-Уитни ранг Сумма тест позволяет сравнении наборов данных, которые не имеют нормального распределения. В т-тест означает двух разных наборов данных, а в сравнении Манна-Уитни Сумма ранг средний сравнивается.

5. Представитель Результаты

Штамм PJ1185: (А ^{+ +} his7:: dis1placR - GFP Chr1 [:: ura4 ⁺ hphMX6 Laco] sid4-mRFP:: kanMX6 cut11-mCherry:: natMX6 ura4-D18-32 leu1 ade6-DN / N) был выращен в EMM . Образец был снят и смонтирован в небольшую камеру роста и фотографии были сделаны (рис. 1А + N). Впоследствии рост средств массовой информации была заменена EMM без ammoniumchloride (EMM-N), и клетки гrown в течение 15 минут при встряхивании. Азота от голода клетки затем монтируется в ростовой камере с EMM-N и фотографии были сделаны (рис. 1А-N). Измерительный инструмент был использован для измерения расстояния между локус (GFP) и SPB (рис. 1B и таблицу 1). Кроме того, расстояние между локус (GFP) и Н. М. был измерен (рис. 1B и таблицу 2). Средний субклеточных расстояния до и после истощения азота сравнивались с использованием SigmaStat-3.5 программного обеспечения (табл. 3). Существовал статистически значимое изменение в локализации генов кластера отходит от М. к СБП. Данные измерения расстояния между GFP и САД было нормальное распределение и, следовательно, средние расстояния (1,777 мкм + N и 1587 мкм-N), могут быть сравнены с использованием Т-теста (табл. 1 и 3). Существовал существенной разницы между двумя средними значениями (р = 0,008, т-тест). Данные измерения расстояния между GFP и Н. М. не было нормального диstribution и, следовательно, среднее расстояние (0 мкм + N и 0,390 мкм-N) сравнивали с помощью Манна-Уитни ранг Сумма теста (табл. 2 и 3). Существовал существенной разницы между двумя средними значениями (Р <0,001, Манна-Уитни ранг Сумма теста).

Рисунок 1. Локализации кластера генов, названный Chr1, отмеченный GFP, изменилась после азотного голодания. (А) Левая колонка, + N, представитель клеточное ядро ​​из клетки, выращенные в EMM правой колонке,-N, представитель клеточное ядро ​​из клетки, выращенные в EMM-N. Зеленый сигнал GFP маркировки кластеров Chr1, красный mRFP и mCherry маркировки СПб и Н. М., соответственно. (Б) То же ядре клетки в виде (), но теперь с измеренными субъядерных расстояния; желтый: диаметр ядра клетки, синий: расстояние между СПБ и GFP сигнала и розовый: расстояние между сигнал GFP и ядерной оболочки.

Таблица 1. Субъядерных измеряется расстояние в мкм PJ1185 штамма выращивают в EMM. Первый ряд, диаметр ячейки (г), второй ряд, расстояние между GFP и СПБ, третий ряд, расстояние между GFP и NM.

Таблица 2. Субъядерных измеряется расстояние в мкм PJ1185 штамма выращивают в EMM-N. Первый ряд, диаметр ячейки (г), второй ряд, расстояние между GFP и СПБ, третий ряд, расстояние между GFP и NM.

Таблица 3. Описательная статистика наблюдается субъядерных расстояния в штамме PJ1185 до (+ N) и после (-N) азотного голодания. Первый ряд: число клеточных измерить, второй ряд: средний диаметр (D), третья строка: средний диаметр (D), четвертый ряд: среднее расстояние между GFP и СПБ, пятой строки: медиана расстояния между GFP и NM.

Нам нечего раскрывать.