Мы описываем технику для маркировки и отслеживания стволовых клеток с FDA, одобрено, суперпарамагнитных оксида железа (Спио), ferumoxytol (Feraheme). Этот клеточный метод визуализации, который использует магнитного резонанса (МР) изображений для визуализации, легко доступных для долгосрочного мониторинга и диагностики успешной или неудачной стволовых клеток engraftments у пациентов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Маркировка стволовых клеток с Ferumoxytol, FDA-Approved Оксид железа наночастиц
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Терапия на основе стволовых клеток обладает значительным потенциалом для регенеративной медицины. Однако многое остается непонятным в отношении кинетики пересаженных клеток in vivo. Неинвазивный метод многократного мониторинга пересаженных стволовых клеток in vivo позволил бы исследователям напрямую отслеживать трансплантацию стволовых клеток и определять успешность или неудачу приживления.
Широкий спектр стволовых клеток продолжает изучаться для бесчисленного множества применений. Данный протокол посвящен трем различным популяциям стволовых клеток: клеткам эмбриональной почки человека 293 (HEK293), мезенхимальным стволовым клеткам человека (hMSC) и индуцированным плюрипотентным стволовым (iPS) клеткам. Клетки HEK 293 получены из клеток эмбриональной почки человека, выращенных в культуре с делетированной ДНК аденовируса 5. Эти клетки широко используются в исследованиях, поскольку они легко культивируются, быстро растут и легко подвергаются трансфекции. hMSC обнаруживаются в костном мозге взрослых. Эти клетки могут реплицироваться в виде недифференцированных клеток, сохраняя мультипотентность или потенциал к дифференцировке в ограниченное число типов клеток. hMSC могут дифференцироваться в линии мезенхимальных тканей, включая остеобласты, адипоциты, хондроциты, ткани сухожилий, мышц и строму костного мозга. iPS-клетки представляют собой генетически перепрограммированные клетки взрослых, которые были модифицированы для экспрессии генов и факторов, сходных с определяющими свойствами эмбриональных стволовых клеток. Эти клетки являются плюрипотентными, что означает их способность дифференцироваться во все клеточные линии 1. И hMSC, и iPS-клетки продемонстрировали регенеративную способность тканей in-vivo.
Магнитно-резонансная (МР) томография в сочетании с использованием суперпарамагнитных наночастиц оксида железа (SPIO) в качестве клеточных меток зарекомендовали себя как эффективный метод отслеживания стволовых клеток in vivo благодаря почти микроскопическому анатомическому разрешению, более длительному периоду полувыведения из крови, позволяющему проводить лонгитюдную визуализацию, и высокой чувствительности к обнаружению клеток, обеспечиваемой МР-визуализацией наночастиц SPIO 2-4. Кроме того, МР-томография с использованием SPIO применима в клинической практике. SPIO состоят из ядра из оксида железа с поверхностным покрытием из декстрана, карбоксидекстрана или крахмала, которое изолирует биореактивное железное ядро от компонентов плазмы. Эти агенты создают локальные неоднородности магнитного поля, что приводит к снижению сигнала на Т2-взвешенных МР-изображениях 5. К сожалению, SPIO больше не производятся. Однако ультрамалые наночастицы SPIO (USPIO) второго поколения представляют собой жизнеспособную альтернативу. Ферумокситол (FerahemeTM) — это один из вариантов USPIO, состоящий из нестехиометрического магнетитового ядра, окруженного оболочкой из полиглюкозного сорбитола карбоксиметилового эфира. Коллоидный размер частиц ферумокситола, определенный методом светорассеяния, составляет 17-30 nm. Молекулярная масса составляет 750 kDa, а константа релаксивности при напряженности МР-поля 2T составляет 58.609 mM-1 sec-14. Недавно FDA одобрил ферумокситол в качестве препарата железа для лечения железодефицитного состояния у пациентов с почечной недостаточностью 6. Наша группа применила этот агент по показаниям «off label» для маркировки клеток. Наш метод демонстрирует эффективную метку стволовых клеток ферумокситолом, что приводит к значительным эффектам МР-сигнала от меченых клеток на МР-изображениях. Эта методика может быть применена для неинвазивного мониторинга терапии стволовыми клетками в доклинических и клинических условиях.
Протокол
1. День 1
1) клетки пластины
- Пластина hMSC в колбе T75 на слияния 80% по крайней мере 18-24 часов до маркировки. См. Таблицу 1 для обучения в альтернативных судов.
2. День 2
2) Подготовить маркировки решение. Этот препарат будет этикетке одного (1) T75 колбу на 80% слияния с концентрацией 400 мкг Fe / мл. См. Таблицу 1 для обучения в альтернативных судов.
- Создать решение (решение 1) путем смешивания 1 мл сыворотки среде и 93,1 мкл ferumoxytol (складе: 30 мг / мл) в 15 мл коническую трубку.
- Создайте второе решение (решение 2) путем смешивания 1 мл сыворотки среде и 7 мкл протамина сульфат (складе: 10 мг / мл) в 15 мл второй конической трубе.
- Разрешить каждого решения, чтобы отдохнуть в течение 5 минут.
- Добавить решения 1 и 2 вместе. Аккуратно перемешайте новое решение этикеток. Разрешить решение, чтобы отдохнуть в течение 5 минут, чтобы позволить USPIO-проtamine комплексов сульфата форме.
- Добавьте 5 мл сыворотки среде в смешанном 2 мл Спио / протамин сульфат раствор для окончательного объемом 7 мл.
3) подготовить клеток для маркировки
- Аспирируйте средств массовой информации из клеток.
- Осторожно промыть клетки сразу с 2-3 мл подогретого Mg / Ca без D-PBS или сыворотки среде, чтобы ополоснуть от остаточной сывороточных белков и других компонентов, или средства массовой информации, которые могут ухудшить отличие поглощение агента и маркировка эффективности. Аспирацию из промыть жидкостью.
4) клетки этикетки
- Добавить полная 7 мл маркировки решение клеток.
- Место клеток в инкубаторе (37 ° C / 5% СО 2) и позволяют клеткам для инкубации в маркировке решение в течение 4 часов.
- Добавить 700 мкл FCS для маркировки решение клетки для достижения окончательного концентрацию в крови на 10%. Сыворотка добавляется для восстановления обогащенного среде которой клетки привыкли, и для оказания помощи в миnimizing гибели клеток, которые могут возникнуть в результате резкого перехода к 24-часовой экспозиции в бессывороточной среде.
- Разрешить клетки инкубировать с маркировки решение для дополнительных 20 часов.
3. День 3
5) Подготовка меченых клеток
- Аспирируйте маркировки решение из клеток.
- Аккуратно промойте клетки с 2-3 мл подогретого Mg / Ca без D-PBS. Аспирацию из PBS. Важно использовать Mg / Ca без PBS, как Mg и Са будет снизить эффективность трипсина в следующем шаге.
- Добавить 2 мл подогретого 0,05% трипсина в клетки и наклона фляжку, чтобы обеспечить всю поверхность колбы покрыта тонким слоем трипсина. Место клеток в инкубаторе (37 ° C / 5% СО 2) и позволяют клеткам, чтобы отдохнуть в течение 5-7 минут или пока клетки начинают отделяться от пластины. Это может быть необходимо для подтверждения отряд под микроскопом. Аккуратно нажмите стороны колбы, если необходимо фаcilitate клеточной поверхности отряда.
- Добавить 4 мл подогретого полный СМИ в колбу для нейтрализации трипсина. Аккуратно промойте колбу с помощью пипетки Трипсин / СМИ / элемент решение вверх и вниз несколько раз. Соберите весь раствор в 15 мл коническую трубку. Центрифуга клетка решение при 400 RCF течение 5 минут.
- Тщательно аспирата супернатант, не нарушая клеточный осадок. Ресуспендируют клеток в 5 мл среды (сыворотки, содержащей или не содержащей сыворотки). Центрифуга клетка решение при 400 RCF течение 5 минут.
- Повторите ячейки мыть, описанных в пункте 5.5. В общей сложности, клетки будут промыть три раза, чтобы удалить остатки, свободного агента контраста в средствах массовой информации и на поверхности клеток.
- Граф клетки в этот момент для достижения наиболее точного подсчета клеток, а клетки будут потеряны во время предыдущей стирки. Выполните проверку жизнеспособности клеток. Клетки готовы для последующего анализа и или пробное нанесение. МРТ может быть выполнена с T1-ю и T2-ю параметрами, потому что, хотя ferumoxytol является Т2-ю контрастное вещество, ferumoxytol также экспонаты T1 эффектов. Представитель T2-ю МРТ параметров, которые могут быть использованы для изображения ferumoxytol меченых клеток включают: FSE или SE_Multislice последовательностей с TR в 2000-2500 мс и TE на 60-80 мс. Для приобретения T1-белого изображения, уменьшение значения TE на FSE или SE_Multislice последовательности или использовать последовательность GRE с высоким и низким TR TE. Рисунок 4 демонстрирует потенциал в естественных условиях применение для помеченных изображений стволовых клеток.
4. Представитель Результаты:
Маркированный клетки демонстрируют значительное потемнение или отрицательный эффект контраста на Т2-взвешенной МРТ и яркости или положительный эффект контраста на T1-взвешенных МРТ (рис. 2). Продольные МРТ и жизнеспособность испытаний, проведенных 5 дней после маркировки не было выявлено значительных сигнала МР и не оказывает значительного влияния на жизнеспособность по сравнению с немеченого управления (данные не представлены).
jove_content "> Маркированный стволовые клетки могут впоследствии быть дифференцированы в различные типы клеток или внутривенно вводят для прижизненного исследования.
Рисунок 1. Схема сроки для маркировки стволовые клетки с наночастицами оксида железа, ferumoxytol.
Рисунок 2. MR изображения сагиттальном сечениях трубы thrrough Эппендорф с ячейками в осадок клеток. ) Немеченого управления. B) Маркированный клетки демонстрируют значительное T2 или отрицательный эффект контрастного вещества на T2-взвешенных FSE или SE_Multislice изображений и T1 или положительный эффект контрастного вещества на Т1-взвешенных последовательностей GRE.
Рисунок 3. Сагиттальный сечения трубы Эппендорф с ячейками в ячейке PELпозволяет. Как ни мало 10000 ferumoxytol меченые клетки могут быть обнаружены с помощью T2-ю МРТ.
Рисунок 4. MR визуализации ferumoxytol меченных стволовые клетки вводили в мышиные желудочков головного мозга. ) Осевой, М. Р. Образ мышиной барин без каких-либо инъекции USPIO меченых стволовых клеток. Б) Осевой, С) корональных и D) сагиттальной МР изображений изображающих T2, негативный эффект контраста USPIO меченных стволовые клетки (белые стрелки) вводили в мышиные мозга.
Таблица 1. Количество адаптация для маркировки клеток в альтернативных судов.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Улучшение эффективности engraftments стволовых клеток имеет решающее значение для продвижения регенеративной медицины. Неинвазивной визуализации технику получения стволовых клеток в естественных условиях значительно усиливает нашу способность понимать механизмы, которые приводят к успешным результатам приживления. Магнитные маркировки МР визуализации, такие как процедуры мы продемонстрировали, позволяет в естественных условиях отслеживания стволовых клеток с МРТ. Магнитное меченых стволовых клеток ране...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Все участники этого исследования не дают раскрытия информации.
Благодарности
Эта работа была поддержана грантом Национального института артрита и костно-мышечной и кожных заболеваний: 3R01AR054458-02S2.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Название реагента | Компания | Номер по каталогу | Комментарии (необязательно) |
| D-MEM высокий уровень глюкозы в | Сигма | D5648 | Или другой носитель базой для требуемой линии стволовых клеток, которые будут использоваться |
| D-PBS (Ca + +, Mg + + бесплатно) | GIBCO | 14190-144 | |
| Трипсин-EDTA 0,05% | Invitrogen | 25300-120 | |
| Эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | |
Ferumoxytol (Feraheme) | AMAG | 59338-0775-01 | |
| Протамина сульфат | APP Pharm. | 22930 |
Ссылки
- Narsinh, K. H., Plews, J., Wu, J. C. Comparison of human induced pluripotent and embryonic stem cells: fraternal or identical twins? Mol Ther. 19, 635-638 (2011).
- Bulte, J. W. In vivo MRI cell tracking: clinical studies. AJR. Am. J. Roentgenol. 193, 314-325 (2009).
- Henning, T. D., Boddington, S., Daldrup-Link, H. E. Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging. J. Vis. Exp. (13), e685-e685 (2008).
- Tallheden, T., Nannmark, U., Lorentzon, M. In vivo MR imaging of magnetically labeled human embryonic stem cells. Life. Sci. 79, 999-1006 (2006).
- Jung, C. W., Jacobs, P. Physical and chemical properties of superparamagnetic iron oxide MR contrast agents: ferumoxides, ferumoxtran, ferumoxsil. Magn. Reson. Imaging. 13, 661-674 (1995).
- Coyne, D. W. Ferumoxytol for treatment of iron deficiency anemia in patients with chronic kidney disease. Expert. Opin. Pharmacother. 10, 2563-2568 (2009).
- Li, Z., Suzuki, Y., Huang, M. Comparison of reporter gene and iron particle labeling for tracking fate of human embryonic stem cells and differentiated endothelial cells in living subjects. Stem Cells. 26, 864-873 (2008).
- Metz, S., Bonaterra, G., Rudelius, M. Capacity of human monocytes to phagocytose approved iron oxide MR contrast agents in vitro. Eur. Radiol. 14, 1851-1858 (2004).
- Nedopil, A., Klenk, C., Kim, C. MR signal characteristics of viable and apoptotic human mesenchymal stem cells in matrix-associated stem cell implants for treatment of osteoarthritis. Invest. Radiol. 45, 634-640 (2010).
- Kraitchman, D. L., Heldman, A. W., Atalar, E. In vivo magnetic resonance imaging of mesenchymal stem cells in myocardial infarction. Circulation. 107, 2290-2293 (2003).
- Stuckey, D. J., Carr, C. A., Martin-Rendon, E. Iron particles for noninvasive monitoring of bone marrow stromal cell engraftment into, and isolation of viable engrafted donor cells from, the heart. Stem Cells. 24, 1968-1975 (2006).
- Henning, T. D., Sutton, E. J., Kim, A. The influence of ferucarbotran on the chondrogenesis of human mesenchymal stem cells. Contrast. Media. Mol. Imaging. 4, 165-173 (2009).
- Arbab, A. S., Yocum, G. T., Kalish, H. Efficient magnetic cell labeling with protamine sulfate complexed to ferumoxides for cellular MRI. Blood. 104, 1217-1223 (2004).
- Nedopil, A. J., Mandrussow, L. G., Daldrup-Link, H. E. Implantation of Ferumoxides Labeled Human Mesenchymal Stem Cells in Cartilage Defects. J. Vis. Exp. (38), e1793-e1793 (2010).
- Arbab, A. S., Yocum, G. T., Wilson, L. B. Comparison of transfection agents in forming complexes with ferumoxides, cell labeling efficiency, and cellular viability. Mol Imaging. 3, 24-32 (2004).
- Babic, M., Horak, D., Trchova, M. Poly(L-lysine)-modified iron oxide nanoparticles for stem cell labeling. Bioconjug Chem. 19, 740-750 (2008).
- Golovko, D. M., T, H. enning, Bauer, J. S. Accelerated stem cell labeling with ferucarbotran and protamine. Eur. Radiol. 20, 640-648 (2010).
- Lu, M., Cohen, M. H., Rieves, D. FDA report: Ferumoxytol for intravenous iron therapy in adult patients with chronic kidney disease. Am. J. Hematol. 85, 315-319 (2010).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
