Методическая статья

Распространение и обнаружение инфекционных молекулярной Клон Maedi-visna Касперского, которые выражает зеленый флуоресцентный белок

9.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/3483

⸱

9 октября 2011 г.

 , 
1Institute for Experimental Pathology, University of Iceland

В этой статье

Краткое содержание

Мы опишем молекулярный клон maedi-visna вирус, который выражает GFP и полностью заразным. Репликация вируса могут быть обнаружены с помощью флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии.

Аннотация

Maedi-visna вируса (СОАС) является лентивирус овец, в результате чего медленно прогрессирующая интерстициальная пневмония и энцефалит 1. Первичные клетки-мишени из MVV в естественных условиях, считаются из моноцитов 2 линии. Некоторые штаммы MVV может реплицировать в другие типы клеток, тем не менее 3,4. Зеленый флуоресцентный белок широко используется маркер для изучения лентивирусов в живых клетках. Мы вставили EGFP гена в геном dUTPase из MVV. Ген dUTPase хорошо сохраняется в большинстве лентивирус штаммов овец и коз и было показано, что играть важную роль в репликации CAEV 5. Тем не менее, dUTPase было показано, что необязательной для репликации молекулярного клона MVV использованные в этом исследовании, как в пробирке и в естественных 6. MVV репликации строго ограничивается клетками овец или коз. Мы используем первичной линии клеток из сосудистого сплетения овец (SCP клеток) для трансфекции и распространения вируса 7. Флуоресцентные MVV полностью инфекционных и EGFP выражение остается стабильной на протяжении как минимум 6 проходов 8. Существует хорошая корреляция между измерениями TCID 50 и EGFP. Этот вирус Поэтому было бы полезно для быстрого обнаружения зараженных клеток в исследованиях клеточный тропизм и патогенности в пробирке и в естественных условиях 8.

Протокол

1. Трансфекция

Молекулярный клон, содержится в двух плазмид, p8XSp5-EGFP и p67r от 12 кб и 4,5 кб соответственно. 9,10

  1. Вырезать эквимолярного количества двух плазмид, то есть 4,4 мкг p8XSp5-EGFP и 1,6 мкг p67r с XbaI и перевязывать до трансфекции.
  2. Для перевязки, используйте 1 Вайс единицу лигазы в 50 мкл реакции и инкубировать при 16 ° С в течение ночи.
  3. При перевязке завершен, инкубировать перевязки смесь при температуре 65 ° С в течение 15 мин для инактивации лигазы. Этот шаг может быть опущен.
  4. За два дня до трансфекции, семена 10 6 SCP клеток в колбе T25 культуре ткани и клетки растут в течение двух дней в 5 мл DMEM + 10% баранины сыворотки и 2 мМ глутамина без антибиотиков для монослоя на 90% слияния. Если клетки не достигла 90% слияния после двух дней, оставьте клеткам расти один дополнительный день.

Примечание: сыворотка баранина может быть заменен эмбриональной телячьей сыворотки (FBS). Мы обычно используют баранину сыворотки, так как некоторые штаммы MVV подавляются ФБС; это MVV штамм не подавляется FBS, однако.

  1. Когда клетки готовы для трансфекции, изменение средних DMEM с 1% сыворотки (баранина сыворотки или ФБС) без антибиотиков.
    Мы используем Lipofectamin 2000 (Invitrogen) для трансфекции.
  2. Развести ДНК в 500 мкл Opti-MEM среде.
  3. Развести 20 мкл Lipofectamin 2000 года в 500 мкл Opti-MEM средних и оставить при комнатной температуре (RT) в течение 5 мин.
  4. После 5 минут инкубации, объединить разбавленный ДНК разбавленным Lipofectamine 2000 (общий объем = 1000 мкл). Тщательно перемешать и выдержать в течение 20-30 минут при комнатной температуре.
  5. Добавить трансфекции смесь (1 мл) для T25 колбу SCP клетки и среднего (5 мл). Смешайте по качалки мягко.
  6. Инкубировать при 37 ° С и 5% СО 2 ночи (18 - 24 ч).
  7. Изменение среды следующий день DMEM с 1% сыворотки, 2 мМ глютамина, 100IU пенициллин и стрептомицин 100IU.
  8. Монитор производство GFP в клетках УПП с помощью инвертированного флуоресцентной микроскопии. Низкая эффективность трансфекции можно ожидать, эти первичные элементы, как правило, 5 - 15%.
  9. Инкубируйте в дальнейшем при 37 ° С, 5% СО 2 в течение нескольких дней, чтобы распространение вируса в колбу. Обычно это занимает 7-14 дней для полной инфекции.
  10. Урожай вируса aliquoting супернатант в пробирки Эппендорф. Спина в микроцентрифужную при 3000 оборотов в минуту в течение 5 минут, чтобы удалить ячейку мусора. Передача супернатант, содержащий вирус нового труб. Хранить при температуре -80 ° C.

2. Титрование вируса

  1. Семенной 3x10 4 SCP клеток в 100 мкл среды DMEM с добавлением 10% сыворотки, 2 мМ глютамина, 100IU/ml пенициллин и стрептомицин 100IU/ml, на лунку в 96 ячейках. Инкубировать при 37 ° С, 5% СО 2.
  2. Если клетки сливной следующий день, изменение средних DMEM с 1% сыворотки, 2 мМ глютамина, 100IU/ml пенициллин и стрептомицин 100IU/ml, 100 мкл в каждую лунку.
  3. Развести вирус следующим образом:
    1. Добавить 180 мкл DMEM с 1% сыворотки, 2 мМ глютамина, 100IU/ml пенициллин и стрептомицин 100IU/ml на скважину до 4 х 10 скважин в 96 с круглым дном или V-нижней пластине.
    2. Для серийного десятикратное разведение в четырех экземплярах, добавить 20 мкл вируса к каждому из 4wells в первом столбце пластины, и используя четырехканальный пипетки, пипетка вверх и вниз, чтобы гарантировать, что образцы тщательно перемешивают. Изменение наконечники и передачи 20 мкл в последующие 4 колодцев и так далее. Оставить последние скважин без вирусов для отрицательного контроля.
  4. Добавить 100 мкл разведения вируса к клеткам и SCP среды.
  5. Инкубировать при 37 ° С и 5% СО 2. Соблюдайте для GFP флуоресценции и цитопатический эффект в течение двух недель.
    Цитопатического эффекты состоят из клеток становятся округлыми и менее прозрачны, чем нормальные клетки с процессами, протягивая, заканчивая многоядерные клетки появляются и гибели клеток.
  6. Рассчитать титр вируса (TCID50) с использованием метода Reed Мюнх 11.

3. FACS анализ зараженных клеток

Примечание: Для быстрого мониторинга репликации вируса, инфицированные клетки могут быть изучены с помощью проточной цитометрии.

  1. Trypsinize инфицированных клеток (около 10 5), мыть 1x с PBS и ресуспендируют в 500 мкл PBS.
  2. Добавить 500 мкл 4% параформальдегида решение (2% конечная концентрация), инкубировать при комнатной температуре в течение 30 мин.
  3. Гранул клеток в микроцентрифужную при 3000 оборотов в минуту в течение 5 мин.
  4. Промыть PBS 2x5 мин и анализа на анализаторе FACScan. Граф 10000 событий.

4. Представитель результаты:

Этот вирус должен быть полностью инфекционных и реплицировать на титр 10 6 - 10 7 TCID 50 / мл. Зараженные клетки флуоресцентной и может быть опрected по проточной цитометрии и флуоресцентной микроскопии. Как правило, GFP могут быть обнаружены в более чем 60% клеток в инфицированных культурах клеток методом проточной цитометрии (рис. 1). Аналогичным образом, когда визуализируется флуоресцентной микроскопии, большинство клетки флуоресцентной (рис. 2А и В).

Рисунок 1
Рисунок 1. FACScan анализа клеток SCP инфицированных KV1772-EGFP вирус через 7 дней после инфицирования.

Рисунок 2
Рисунок 2. Фазовый контраст микроскопии клеток SCP инфицированных KV1772-EGFP после 7 дней инкубации (). То же клетки визуализируется флуоресцентной микроскопии (B).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

GFP выражения молекулярного клона MVV, представленные здесь должны быть полезен для анализа клетки-хозяина взаимодействия и патогенность MVV как в пробирке и в естественных условиях. Вирус, полученный после 7-14 дней репликации, несомненно, приобрел некоторые мутации из-за неточности обратной транскриптазы. Однако Есть ограничения на использование этого клона как единый вектор цикла. Во-первых, использование клонов ограничен клетки овец и коз. Эффективности трансфекции этих клеток с помощью нашего построить только 5-15%...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Эта работа финансировалась Фондом исландского исследований и Университета Исландии фонд исследований.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Название реагента Компания Номер в каталоге
DMEM Гибко 10938025
Opti-MEM Гибко 51985018
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668019

Ссылки

  1. Sigurdsson, B., Palsson, P. A., Grimsson, H. Visna, a demyelinating transmissable disease of sheep. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 14, 389-403 (1957).
  2. Gorrell, M. D., Brandon, M. R., Sheffer, D., Adams, R. J., Narayan, O. Ovine lentivirus is macrophagetropic and does not replicate productively in T lymphocytes. J. Virol. 66, 2679-2688 (1992).
  3. Andresdottir, V. Biological and genetic differences between lung- and brain-derived isolates of maedi-visna virus. Virus Genes. 16, 281-293 (1998).
  4. Georgsson, G., Houwers, D. J., Palsson, P. A., Petursson, G. Expression of viral antigens in the central nervous system of visna-infected sheep: an immunohistochemical study on experimental visna induced by virus strains of increased neurovirulence. Acta Neuropathol. 77, 299-306 (1989).
  5. Turelli, P., Guiguen, F., Mornex, J. F., Vigne, R., Querat, G. dUTPase-minus caprine arthritis-encephalitis virus is attenuated for pathogenesis and accumulates G-to-A substitutions. J. Virol. 71, 4522-4530 (1997).
  6. Petursson, G. Visna virus dUTPase is dispensable for neuropathogenicity. J. Virol. 72, 1657-1661 (1998).
  7. Sigurdsson, B., Thormar, H., Palsson, P. A. Cultivation of visna virus in tissue culture. Arch Gesamte Virusforsch. 10, 368-380 (1960).
  8. Gudmundsdottir, H. S., Olafsdottir, K., Franzdottir, S. R., Andresdottir, V. Construction and characterization of an infectious molecular clone of maedi-visna virus that expresses green fluorescent protein. J. Virol. Methods. 168, 98-102 (2010).
  9. Andresson, O. S. Nucleotide sequence and biological properties of a pathogenic proviral molecular clone of neurovirulent visna virus. Virology. 193, 89-105 (1993).
  10. Skraban, R. Naturally occurring mutations within 39 amino acids in the envelope glycoprotein of maedi-visna virus alter the neutralization phenotype. J. Virol. 73, 8064-8072 (1999).
  11. Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1938).
  12. Berkowitz, R. D., Ilves, H., Plavec, I., Veres, G. Gene transfer systems derived from Visna virus: analysis of virus production and infectivity. Virology. 279, 116-129 (2001).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

TCID50

Похожие статьи