Техника для исследования разделов липидного плота флуоресцентных белков в мембране живой клетки описывается. Он использует различия в диффузии время белки, расположенные внутри или за пределами липидного плоты. Приобретение может осуществляться динамически в контрольных условиях или после наркомании.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Определение липидного плота разделов флуоресцентно с метками зонды в живых клетках при флуоресцентной спектроскопии корреляции (FCS)
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
За последние пятнадцать лет широко распространилось представление о том, что клеточные мембраны не являются гомогенными и полагаются на микродомены для осуществления своих функций. Липидные рафты представляют собой мембранные микродомены, обогащенные холестерином и сфинголипидами. Они играют роль в таких физиологических процессах клетки, как передача сигналов и транспорт1,2, но также считаются ключевыми факторами в развитии ряда заболеваний, включая вирусные или бактериальные инфекции и нейродегенеративные заболевания3.
Тем не менее факт их существования все еще является предметом дискуссий4,5. В частности, размер липидных рафтов оценивается примерно в 20 nm6, что значительно ниже предела разрешения обычной микроскопии (около 200 nm), что делает невозможной их прямую визуализацию. До настоящего времени основными методами оценки распределения интересующих белков внутри липидных рафтов были изоляция детергент-резистентных мембран (DRMs) и ко-патчинг с антителами. Несмотря на широкое применение благодаря относительной простоте реализации, эти методы были подвержены возникновению артефактов и, следовательно, подвергались критике7,8. Таким образом, потребовались технические усовершенствования, чтобы преодолеть эти артефакты и получить возможность исследовать распределение липидных рафтов в живых клетках.
Здесь мы представляем метод чувствительного анализа распределения белков или липидов с флуоресцентными метками по липидным рафтам в плазматической мембране живых клеток. Этот метод, называемый флуоресцентной корреляционной спектроскопией (FCS), основан на разнице в диффузионных временах флуоресцентных зондов, расположенных внутри или вне липидных рафтов. Фактически, как показано и на искусственных мембранах, и в культурах клеток, зонды диффундируют гораздо быстрее вне плотных липидных рафтов, чем внутри них9,10. Для определения времени диффузии с помощью конфокального микроскопа измеряют мельчайшие флуоресцентные флуктуации в зависимости от времени в фокальном объеме (примерно 1 фемтолит), расположенном на плазматической мембране клеток (Рис. 1). На основе этих флуктуаций затем строятся автокорреляционные кривые, которые аппроксимируются соответствующими математическими моделями диффузии11.
Метод FCS может быть использован для определения распределения различных зондов в липидных рафтах, при условии, что они помечены флуоресцентной меткой. Флуоресцентное мечение может быть достигнуто путем экспрессии флуоресцентных слитных белков или путем связывания флуоресцентных лигандов. Кроме того, FCS может применяться не только в искусственных мембранах и клеточных линиях, но и в первичных культурах, как было описано в недавней работе12. Этот метод также позволяет отслеживать динамику распределения в липидных рафтах после добавления препарата или изменения состава липидов мембраны12.
Протокол
1. Калибровка установки FCS
- Начать конфокальной микроскопии, лазеры, компьютеры, инкубатор для температуры и CO 2 контроля.
- Убедитесь в том, SPAD (Single лавины фотонов Diode) на флуоресценцию и фильтр внутри SPAD хорошо подходит для вашего образца. Убедитесь, что SPAD синхронизированы во времени. Остерегайтесь только начать ФТС программное обеспечение только ваш SPAD настройки готовы к приобретению.
- Подготовить новое решение холерного токсина-Alexa488 разводят в PBS достичь концентрации 1 мкг / мл (17,5 нм).
- Оптимизация конфокальной микроскопии решения с использованием внутреннего обнаружения под микроскопом.
- Включите отметить режим сканирования и выбрать точку в решении образца. Убедитесь, что длительность лазерного освещения достаточно долго, чтобы выполнить свой ФТС приобретения (> 5 минут).
- Переключение в режим внешнего обнаружения SPAD и программное обеспечение ФТС. Следите за своим флуоресцентного сигнала и убедитесь, что он также специальнойТед SPAD (достаточно сигнала, но не насыщение, от 10 000 до 50 000 имп / с нормально). В случае необходимости, изменить положение г, усиление и / или мощности лазера для достижения правильного сигнала флуоресценции.
- Получите 10 комплектов 30 секунд измерений. Время сбора данных должны быть оптимизированы для вашего образца (компромисс между лучшим отбора проб и фотообесцвечивания проблем).
- Анализ данных (см. шаг 4), чтобы гарантировать, что у вас есть авто-корреляции кривой, соответствующей одному флуоресцентный вид диффузии в растворе (уравнение на рис. 2) и о том, что время диффузии, полученные после установки правильно (около 0,2 мс) (рис. . 3).
2. Окраска живых клеток с маркером липидов Плоты
- Пластина НЕК293 на 8-а Labteks покрытые поли-L-лизин (1mg/ml) за день до изображения, чтобы убедиться, что их адгезии является правильным. Используйте среде без фенола красного обеспечения нет возмущения сигнала флуоресценции.
- Промойте клетки дважды HBSS (буферизованный солевой раствор Хэнка).
- Добавить холерного токсина-Alexa488 (1 мкг / мл) / BSA (0,1%) в 500 мкл HBSS в клетки в течение 30 минут при температуре 37 ° C. Холерный токсин связывается с ганглиозида GM1, как известно, преимущественно разделы в липидных плотах.
- Промойте клетки дважды HBSS (буферизованный солевой раствор Хэнка).
3. ФТС сбора данных на живые клетки
- Поместите окрашенных клеток на предметном столике микроскопа. Убедитесь, что температура и CO2 условия являются оптимальными в противном случае это может привести к артефактов в диффузии раз.
- Оптимизация конфокальной микроскопии клетки интереса с использованием внутреннего обнаружения под микроскопом (рис. 4).
- Включите отметить режим сканирования и выбрать пункт в плазматической мембране клетки интерес. Выполните 1-2 изображения в реальном времени клетки, чтобы убедиться в клетке не двигается во время приобретения.
- Переключение в режим внешнего обнаружения SPAD и ФТС мягкийизделия. Следите за своим флуоресцентного сигнала и убедитесь, что он хорошо подходит для SPAD (достаточно сигнала, но не насыщение, от 10 000 до 50 000 имп / с это нормально). В случае необходимости, изменить положение г, усиление и / или мощности лазера для достижения правильного сигнала флуоресценции. Если этого не достаточно, вы можете рассмотреть вопрос об изменении условий окрашивания.
- Получите 10 образцов 30 секунд измерений. Как и большинство клеток самофлюоресцирующими, вы можете увидеть снижение флуоресценции в течение первых приобретений, в связи с авто-флуоресценция исчезает.
4. Анализ данных ФТС
- Установить интервал корреляции и создавать авто-корреляции кривых с помощью программного обеспечения ФТС. Интервал корреляции, как правило, варьируется от кратчайшие разрешимы задержкой до самого длинного сроки (в статистике измерений становится все более и более неадекватным, когда максимальное время корреляция приближается общее время приобретения, максимальное время задержки ограничено до 80% Приобретение время на PicoquaП программное обеспечение).
- Для каждого образца, экспорт файлов, соответствующих флуктуации флуоресценции и авто-корреляции в зависимости от времени.
- С помощью анализа данных и установки программ, таких как происхождение Pro импортировать файлы.
- Для каждого образца, убедитесь, что нет фотообесцвечивания во время приобретения, т.е. флуоресценции остается стабильной в течение 30 секунд. Отменить любые меры отображения фотообесцвечивания как это может привести к искусственной более длительное время диффузии.
- Убедитесь, что форма оставшихся ФТС кривые правильно (см. рис 5). Определение средней кривой FCS.
- Установите кривой с соответствующей математической модели (рис. 2). Это подходит даст вам время диффузии (ы), а доля молекул, диффундирующих с этим (ESE), диффузия раз (а).
5. Представитель Результаты
Пример калибровки FCS с холерного токсина-Alexa488 решение показано на рисунке 3 сильный>. Убедившись, что отдельные меры флуоресценции в зависимости от времени не показали фотообесцвечивания (рис. 3А), индивидуальные и средний ФТС кривые были рассчитаны. Средний ФТС кривые были оснащены уравнений, соответствующих различным моделям диффузии (пример на рисунке 2). Параметр классически считается определить качество подгонка коэффициент детерминации R 2. Чем ближе R 2 к 1, тем лучше подходит. В этом случае наиболее точную модель, чтобы соответствовать средней кривой FCS является одним описанием населения флуоресцентных молекул, диффундирующих свободно в трех измерениях (уравнения 1 на рисунке 2 и рис. 3б). Время диффузии происходит от нужным составляет 0,32 мс. Остатки от построения кривой (рис. 3) и R 2 фактора (0,99906) дают оценки качества подгонки.
Пример анализа ФТС для холерного токсина-Alexa488 окрашенных HEK293 клеток показано на рисунке 5. Многостадийного среднего ФТС форма кривой свидетельствует о существовании населения флуоресцентных молекул с различным временем диффузии. Наилучшим образом подходит для этой кривой соответствует модели с тремя популяциями флуоресцентных зондов: два с препятствуют диффузии (диффузия в двух измерениях, как в плоскости мембраны) и один свободно диффундирующих в трех измерениях (уравнения 2 на рисунке 2 и рис 5) . Последнее населения соответствует флуоресцентных молекул, движущихся вне плоскости мембраны, т. е. либо обязательными или отмены привязки к цели мембраны, достигая через мембраны путем секреции или утилизации, или выходе из мембраны путем эндоцитоза. Два раза в диффузионной мембраны, соответствующие холерного токсина связаны с GM1, были 2 мс (25% молекул), что соответствует диффузии вне липидного плоты, и 75 мс (50% молекул), что соответствует диффузии в липидных рафтах . Пожалуйста, обратите внимание, что любое photobleachING во время сбора приведет к искусственному увеличению времени диффузии таким образом, возможно создание уклон в сторону локализации GM1 в липидных области плот.
Рисунок 1. Схематическое изображение ФТС настройки (картинка изменилась с Marquer соавт. 12)
Рисунок 2. Пример диффузионной модели и соответствующие уравнения, используемые в соответствии автокорреляционной кривой. Структура параметра S можно записать в виде S = Z 0 / б 0, Z 0 эффективное фокусное радиус вдоль оптической оси на 1 / е 2 интенсивность и w0 эффективного лаteral координационного радиусом в 1 / е 2 интенсивности. Эти значения могут быть извлечены из классической точки распространения функции (НПФ) измерений.
Рисунок 3. Оценка времени диффузии холерного токсина-Alexa488 в раствор для калибровки FCS. А) флуоресценции колебания в зависимости от времени типичный пример приобретения 30 секунд. Б) средняя автокорреляционной кривой, полученной из 10 образцов 30 секунд приобретение оснащены уравнение 1 (см. рисунок 2). C) Остатки от кривой.
Рисунок 4. НЕК-293 клетки окрашиваются холерного токсина-Alexa488. Клетки были обследованы на микроскоп SP5 конфокальной (Leica Microsystems, Wetzlar, Германия) с внутренним 488nm лазерного луча. Флуоресценции были собраны с x60 план апохромат цель погружения нефти от 500 дои 650 нм.
Рисунок 5. Оценка времени диффузии холерного токсина-Alexa488 в плазматической мембране клеток НЕК293. А) Средние автокорреляционной кривой оснащены уравнение 2 (см. рисунок 2). Б) Остатки от кривой. (С изменениями от Marquer соавт. 12)
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Метод ФТС представленные здесь позволяет чувствительный и быстрый анализ разделов липидного плота флуоресцентных зондов интерес в живых клетках. ФТС сочетает в себе точность локализации конфокальной микроскопии с чувствительностью одного счета фотонов. Основное различие между ФТС и стандартными биохимическими методами в том, что ФТС обеспечивает абсолютную решимость раздела липидный плоты цели и не является относительная раздел как в случае DRMs изоляции или совместного исправления.
Приобрет...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Эта работа была поддержана грантом Agence Nationale-де-ла Recherche (ChoAD). Мы также благодарны Фонду ICM (институт дю Cerveau и др. де-ла-Moelle) за их финансовую поддержку.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Название реагента | Компания | Номер по каталогу | Комментарии |
| Холерный токсин субъединицы B-Alexa 488 | Invitrogen | C-34775 | МВт (пентамера) = 57 кг / моль |
| Конфокальной микроскопии | Leica | SP5 | |
| Инкубатор для температуры и СО2 контроль | Жизнь изображений услуги | Куба и коробки | |
| SPAD (Single лавины фотонов Diode) | MPD (Micro фотонных устройств) | PDM серии (100 мкм чувствительная область) | |
| Высокий перевал 488 нм фильтра | Semrock | 488 нм блокирование края BrightLine долго фильтр Part #ails.aspx? ID = FF01-488/LP-25 "целевых =" _blank "> FF01-488/LP-25 | |
| ФТС блок детектирования | Picoquant | Picoharp 300 модулей | |
| Приобретение и автокорреляции программного обеспечения | Picoquant | SymPhoTime | |
| Установка программного обеспечения | OriginLab | OriginPro8 |
Ссылки
- Brown, D. A., London, E. Functions of lipid rafts in biological membranes. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 14, 111-136 (1998).
- Simons, K., Gerl, M. J. Revitalizing membrane rafts: new tools and insights. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 688-699 (2010).
- Simons, K., Ehehalt, R. Cholesterol, lipid rafts, and disease. J. Clin. Invest. 110, 597-603 (2002).
- Munro, S. Lipid rafts: elusive or illusive. Cell. , 115-377 (2003).
- Shaw, A. S. Lipid rafts: now you see them, now you don't. Nat. Immunol. 7, 1139-1142 (2006).
- Pralle, A., Keller, P., Florin, E. L., Simons, K., Horber, J. K. Sphingolipid-cholesterol rafts diffuse as small entities in the plasma membrane of mammalian cells. J. Cell Biol. 148, 997-1008 (2000).
- Brown, D. A., London, E. Structure and function of sphingolipid- and cholesterol-rich membrane rafts. J. Biol Chem. 275, 17221-17224 (2000).
- Sharma, P., Sabharanjak, S., Mayor, S. Endocytosis of lipid rafts: an identity crisis. Semin. Cell Dev. Biol. 13, 205-214 (2002).
- Kahya, N., Scherfeld, D., Bacia, K., Poolman, B., Schwille, P. Probing lipid mobility of raft-exhibiting model membranes by fluorescence correlation spectroscopy. J. Biol. Chem. 278, 28109-28115 (2003).
- Bacia, K., Scherfeld, D., Kahya, N., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy relates rafts in model and native membranes. Biophys J. 87, 1034-1043 (2004).
- Kim, S. A., Heinze, K. G., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy in living cells. Nat. Methods. 4, 963-973 (2007).
- Marquer, C. Local cholesterol increase triggers amyloid precursor protein-Bace1 clustering in lipid rafts and rapid endocytosis. FASEB J. 25, 1295-1305 (2011).
- Tian, Y., Martinez, M. M., Pappas, D. Fluorescence correlation spectroscopy: a review of biochemical and microfluidic applications. Appl. Spectrosc. 65, 115A-124A (2011).
- Haustein, E., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy: novel variations of an established technique. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 36, 151-169 (2007).
- Ilien, B. Pirenzepine promotes the dimerization of muscarinic M1 receptors through a three-step binding process. J. Biol. Chem. 284, 19533-19543 (2009).
- Lieto, A. M., Cush, R. C., Thompson, N. L. Ligand-receptor kinetics measured by total internal reflection with fluorescence correlation spectroscopy. Biophys. J. 85, 3294-3302 (2003).
- Thompson, N. L., Burghardt, T. P., Axelrod, D. Measuring surface dynamics of biomolecules by total internal reflection fluorescence with photobleaching recovery or correlation spectroscopy. Biophys. J. 33, 435-454 (1981).
- Thompson, N. L., Steele, B. L. Total internal reflection with fluorescence correlation spectroscopy. Nat. Protoc. 2, 878-890 (2007).
- Eggeling, C. Direct observation of the nanoscale dynamics of membrane lipids in a living cell. Nature. 457, 1159-1162 (2009).
- Kolin, D. L., Wiseman, P. W. Advances in image correlation spectroscopy: measuring number densities, aggregation states, and dynamics of fluorescently labeled macromolecules in cells. Cell Biochem. Biophys. 49, 141-164 (2007).
- Shvartsman, D. E., Kotler, M., Tall, R. D., Roth, M. G., Henis, Y. I. Differently anchored influenza hemagglutinin mutants display distinct interaction dynamics with mutual rafts. J. Cell Biol. 163, 879-888 (2003).
- White, R. Holin triggering in real time. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 798-803 (2011).
- Petersen, N. O., Hoddelius, P. L., Wiseman, P. W., Seger, O., Magnusson, K. E. Quantitation of membrane receptor distributions by image correlation spectroscopy: concept and application. Biophys. J. 65, 1135-1146 (1993).
- Hebert, B., Costantino, S., Wiseman, P. W. Spatiotemporal image correlation spectroscopy (STICS) theory, verification, and application to protein velocity mapping in living CHO cells. Biophys. J. 88, 3601-3614 (2005).
- Digman, M. A. Measuring fast dynamics in solutions and cells with a laser scanning microscope. Biophys. J. 89, 1317-1327 (2005).
- Digman, M. A. Fluctuation correlation spectroscopy with a laser-scanning microscope: exploiting the hidden time structure. Biophys. J. 88, L33-L36 (2005).
- Nohe, A., Keating, E., Fivaz, M., van der Goot, F. G., Petersen, N. O. Dynamics of GPI-anchored proteins on the surface of living cells. Nanomedicine. 2, 1-7 (2006).
- Semrau, S., Schmidt, T. Particle image correlation spectroscopy (PICS): retrieving nanometer-scale correlations from high-density single-molecule position data. Biophys. J. 92, 613-621 (2007).
- Bates, I. R. Membrane lateral diffusion and capture of CFTR within transient confinement zones. Biophys. J. 91, 1046-1058 (2006).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
