Методическая статья

Трансплантация стволовых клеток в В пробирке Имитация ишемии / реперфузии модели

13.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/3575

⸱

5 ноября 2011 г.

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Human Physiology and Clinical Experimental Research, Semmelweis University

В этой статье

Краткое содержание

Мы демонстрируем, как настроить В пробирке Ишемии / реперфузии модель и как оценить эффект от терапии стволовыми клетками на постишемического сердечных клеток.

Аннотация

Стволовые протоколов трансплантации клеток находят свой ​​путь в клиническую практику 1,2,3. Получение лучших результатов, делая протоколы более надежной, и найти новые источники для имплантируемых клетки находятся в центре внимания недавнего исследования 4,5. Исследование эффективности клеточной терапии является не простой задачей и новые инструменты необходимы для исследования механизмов, вовлеченных в процесс лечения 6. Мы разработали экспериментальный протокол ишемии / реперфузии, чтобы позволить наблюдение сотовой связи и даже субклеточные механизмы при ишемии / реперфузии и после трансплантации стволовых клеток и оценить эффективность клеточной терапии. H9c2 клетки cardiomyoblast были размещены на культуре клеток пластины 7,8. Ишемия был смоделирован с 150 минут в глюкозу среде без кислорода ниже уровня 0,5%. Затем, нормальные средства массовой информации и уровень кислорода вновь были введены, чтобы имитировать реперфузии. После кислородное голодание глюкозы,поврежденные клетки обрабатывали трансплантации меченых костного мозга человека производных мезенхимальных стволовых клеток, добавив их в культуру. Мезенхимальные стволовые клетки являются предпочтительными в клинических испытаниях, потому что они легко доступны с минимальной инвазивной хирургии, легко расширяемой и аутологичных. После 24 часов совместного культивирования клетки были окрашены кальцеин и этидий-гомодимера провести различие между живыми и мертвыми клетками. Эта установка позволяет исследовать межклеточных соединений с помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии и количественно выживаемость постишемического клетки с помощью проточной цитометрии. Конфокальной микроскопии показали, взаимодействия двух клеточных популяций, таких как слияние клеток и формирование межклеточного нанотрубок. Анализ проточной цитометрии выявлено 3 скопления поврежденных клеток, которые могут быть нанесены на график и статистическому анализу. Эти группы населения могут быть исследованы отдельно и выводы можно сделать из этих данных об эффективности моделируемыхтерапевтический подход.

Протокол

1. Подготовка H9c2 клетки cardiomyoblast

H9c2 cardiomyoblasts крысы были получены из АТСС (Везель, Германия) и расширена в высокий уровень глюкозы (4,5 г / л) DMEM, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 4 мМ L-глутамина, 100 ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина. H9c2 миобластов клеточной линии происходит от эмбрионального сердца крысы, он используется как в пробирке модель для скелетных и сердечной мышцах 8,9.

Подготовка 12-луночного планшета из H9c2 клеток:

  1. Удалить из питательной среды чашки Петри из H9c2 клеток.
  2. Вымойте клетки в два раза с 5 мл PBS и переварить с 2-3 мл 0,05% трипсина / ЭДТА.
  3. Место чашки Петри в течение 5 минут в 37 ° C инкубатора.
  4. Запрет трипсина с 10 мл культуральной среде DMEM.
  5. Спином вниз клетки при 1200 оборотов в течение 8 минут.
  6. После удаления надосадочной, ресуспендирования клеток в 1 мл DMEM культуральной среде и считать клетки с использованием гемоцитометра Голубой Трипан окрашивания.
  7. Семенной 30000 H9c2 клеток в 2 мл DMEM на лунку в 12-луночного планшета.
  8. Место пластинки в 37 ° C CO 2 инкубаторе в течение 24 часов.

2. Имитация ишемии / реперфузии

Ишемии / реперфузии был смоделирован в пробирке, выполняя кислорода глюкоза депривации (OGD) на H9c2 клеточных культурах. Эта процедура была выполнена на этапе Zeiss конфокальной микроскопии с PeCon инкубации клеточной системы (Эрбах, Германия), позволяющая наблюдения клеток при OGD.

  1. Удалить среде стремление с 12 лунками в H9c2 клеток.
  2. Вымойте клетки дважды с PBS.
  3. Добавьте 3 мл среды без глюкозы на лунку.
  4. Место пластинки в системе инкубации клеток.
  5. Начало газообразный азот для продувки кислородом из инкубационного системы.
  6. Подождите, пока уровень кислорода до 0,5%, то включите таймер. 0,5% кислорода означает примерно на 3 мм рт.ст. парциального напряжения. Тема клетки 150 минут моделирования ишемии.
  7. В конце моделирования ишемии, удалить глюкозы среде, свободной от клеток.
  8. Внести 2 мл нормальной питательной среды для скважин.
  9. Место 12-луночного планшета на 30 минут в 37 ° C CO 2 инкубаторе, это "реперфузионного периода".

3. Подготовка спасения мезенхимальных стволовых клеток

Костный мозг человеческого происхождения, был взят под T75 колб и разбавляют Средний Дульбеко изменения Орла (DMEM) культуральной среде, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS), 100 ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина, 4 мМ L-глутамина и 1 г / л глюкозы. Колбы инкубировали при 37 ° С в полностью увлажненной атмосфере 5% CO 2 в течение 3 дней. После инкубационного периода BMSCs придерживался поверхности колбы и остальные компоненты костного мозга были устранены путем промывки PBS. Использованы BMSCs были между 1 и 5 места в экспериментах. Тожtity клеток было подтверждено наличие линии конкретной поверхности клеток маркеры с проточной цитометрии. Гемопоэтических построчная оплата конкретных поверхностные маркеры (CD34, CD45) и мезенхимальные маркеры поверхности (CD73, CD90, CD105 и CD166) исследовались.

Во время моделирования ишемии, подготовить спасательные мезенхимальных стволовых клеток для трансплантации.

  1. Развести флуоресцентного красителя Vybrant сделал в 1:200 отношение в культуральной среде DMEM.
  2. Аспирируйте среды от спасения клеток и добавить 300 мкл DMEM с Vybrant сделал.
  3. Место чашку Петри на 30 минут в 37 ° C CO 2 инкубатора.
  4. Удалить из питательной среды чашки Петри мезенхимальных стволовых клеток.
  5. Вымойте клетки в два раза с 5 мл PBS и переварить с 2-3 мл 0,05% трипсина / ЭДТА.
  6. Место чашки Петри в течение 5 минут в 37 ° C инкубатора.
  7. Запрет трипсина с 10 мл культуральной среде DMEM.
  8. Спином вниз клетки при 1200 оборотов в течение 8 минут.
  9. После удаления Супеrnatant, ресуспендирования клеток в 1 мл DMEM культуральной среде и считать клетки с использованием гемоцитометра Голубой Трипан окрашивания.
  10. Через 30 минут в конце реперфузии добавить 20000 мезенхимальных стволовых клеток на лунку в постишемического H9c2 сердечной миобластов.
  11. Место совместно культуре клеток в 37 ° C CO 2 инкубаторе в течение 24 часов.

4. Анализ с конфокальной микроскопии

После моделирования ишемии / реперфузии, клетки инкубируют в нормальной культурной среде в течение 24 часов.

  1. Через 24 часов клетки мыть два раза PBS.
  2. Пятно клеток в 500 мкл живых / мертвых раствор красителя в течение 30 минут (5 нМ кальцеин и 400 нМ этидия-гомодимера-2 в PBS) (5x10 4 клеток / мл).

Оценка конфокальных изображений для живых и мертвых клеток выбранных по морфологии и флуоресценции могут быть выполнены с ImageJ программное обеспечение (Национальный институт здоровья, США). В случае со-культур, МСК можно отличить от H9c2 клетки из-за их Vybrant DiD ячейки маркировки. Отношение мертвых клеток может быть оценена в 4-х независимых полей зрения (цель 10 раз) для каждой культуры в слепым 10.

H9c2 cardiomyoblasts культивировали на 42 мм покровные стекла также могут быть исследованы с течением времени микроскопии видео перерыва во время и после ишемии / реперфузии использованием системы клетки инкубации конфокальной микроскопии. Сотовые к клетке взаимодействий, таких как слияние клеток и формирование межклеточного нанотрубки могут быть изучены с течением времени.

5. Анализ с помощью проточной цитометрии

После моделирования ишемии / реперфузии, клетки инкубируют в нормальной культурной среде в течение 24 часов.

  1. После 24 часов, сбор питательных сред. Очень важно собрать культуральной среде и потому, что некоторые мертвые клетки могли бы отделен от поверхности блюдо культуры в 24-часовой инкубацииТион.
  2. Вымойте клетки дважды с PBS и переварить с 0,05% трипсина-EDTA.
  3. Запрет трипсина с культуральной среде DMEM.
  4. Спином вниз клетки и собрано культуральной среде при 1200 оборотов в минуту (примерно 150-200г) в течение 8 минут.
  5. Удалите супернатант.
  6. Приостановить клеток в 500 мкл жить / мертвых раствор красителя в течение 30 минут (5 нМ кальцеин и 400 нМ этидия-гомодимера-2 в PBS) (5x10 4 клеток / мл).
  7. Передача клетки проточной цитометрии труб.
  8. Начало CellQuest Pro программное обеспечение.
  9. Для установки проточного цитометра для измерения, подготовить контрольные образцы живых и мертвых клеток.
    1. Пластина H9c2 клетки при плотности 3х10 4 в 12-луночных планшет, как описано в пункте 1.
    2. Подготовка живой клетки управления с одной trypsinisation, как описано в пункте 1.
    3. Подготовка мертвых управления ячейки путем обработки 10 мкМ H 2 O 2 в течение 1 часа.
    4. После trypsinisation, resuspenг живых и мертвых управления ячейки в 500 мкл жить / мертвых раствор красителя (5 нМ кальцеин-АМ и 400 нМ этидия-гомодимера-2 в PBS).
  10. Настройки прибора должна быть отрегулирована таким образом живые клетки являются кальцеин положительные и этидия гомодимера отрицательным, в то время как мертвые клетки кальцеин отрицательные и положительные этидия гомодимера.
  11. Процент таких групп может быть выражено в виде столбиков на графике и статистический анализ может быть выполнен на этих значениях.
  12. Мера различных экспериментальных групп.

6. Представитель результаты:

Наши результаты показали, что добавил мезенхимальных стволовых клеток может улучшить выживаемость постишемического сердечных клеток. Конфокальной микроскопии изображений показал, прямой клетка-клетка взаимодействий, таких как частичное соединение мембраны или межклеточной нанотрубки, которые, вероятно, играют важную роль в наблюдаемой защиты 10. Эти нанотрубки пролет на расстоянии нескольких ячейки гiameters, и их диаметров от 200 до 500 нм (белые стрелки).

figure-protocol-1
Рисунок 1. Нанотрубки образовании между клетками. Нанотрубок образования (белая стрелка) между Vybrant Дио помечены cardiomyoblasts и Vybrant DiD помечены мезенхимальные стволовые клетки.

Анализ Проточная цитометрия показала населения на выживание и некротические cardiomyoblasts и мезенхимальных стволовых клеток. Интересно, что мы наблюдали и третий, "пострадавший" cardiomyoblast клеточной популяции в котором содержится кальцеин но и содержала показатель мертвых клеток, этидия гомодимера (рис. 2).

figure-protocol-2
Рисунок 2. Представитель интернет-участок различных клеточных популяций после моделирования ишемии.

Оценки нескольких экспериментов шозамуж, что добавление мезенхимальных стволовых клеток, чтобы постишемического cardiomyoblast H9c2 значительно увеличилась доля живых клеток по сравнению с сердечной миобластов культурной только после ишемии (рис. 3).

figure-protocol-3
Рисунок 3. . Влияние стволовых клеток, лечение на постишемического cardiomyoblasts Процент живых клеток было значительно сокращено после моделирования ишемии по сравнению с контролем (контроль по сравнению с ИК-модели: 90,36 ± 2,60 против 10,52 ± 0,48, *** р> 0,001), которые увеличились после того мезенхимальных стволовых клеток (IR модели по сравнению с ИК + BMSC: 10,52 ± 0,48 против 25,21 ± 2,13, *** р> 0,001). Данные представляют собой средние значения ± SEM. Статистический анализ данных проводился с использованием одностороннего дисперсионного анализа с несколькими сравнения Тьюки постфактум тест.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Продемонстрировала протокол в пробирке подход к гораздо более сложный вопрос о стволовых клеток при инфаркте миокарда, при всех преимуществах и недостатках такой модели. Очевидно, она не может отражать комплекс (например, иммунологические) события, происходящие во время и после инфаркта миокарда, но может сосредоточиться на непосредственном воздействии на клетки добавил постишемического клеток. Эффекты моделирования ишемии при H9c2 cardiomyoblasts сильно зависят от времени OGD, на пассаж из отработавших батарей и O

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Эта работа была поддержана OTKA (венгерский научный фонд исследований) D45933, T049621, ТЕТ (венгерский научно-технический фонд) A4/04, Arg-17/2006 и SIN, Бойяи, Öveges Стипендии и TÁMOP 4.2.2-08 / 1 / KMR-2008-0004 и 4.2.1 / B 09/1/KMR-2010-0001. OTKA 83803. Мы хотели бы поблагодарить Уильяма Gesztes за предоставление голос за кадром.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Название реагента Компания Номер по каталогу Комментарии
кальцеин-AM Молекулярные зонды L3224, C3099 http://www.invitrogen.com
этидия гомодимера-2 Молекулярные зонды L3224, E3599 http://www.invitrogen.com
Vybrant DiD Молекулярные зонды V22887 http://www.invitrogen.com

Таблица 1. Реактивы.

Наименование оборудования Компания Комментарии (необязательно)
PeCon ячейки инкубации система Zeiss микроскопы PeCon GmbH www.pecon.biz/

Таблица 2. Оборудование.

Ссылки

  1. Dimmeler, S., Burchfield, J., Zeiher, A. M. Cell-Based Therapy of Myocardial Infarction. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28, (2008).
  2. Kim, S. U., de Vellis, J. Stem cell-based cell therapy in neurological diseases: A review. Journal of Neuroscience Research. 87, 2183-21 (2009).
  3. Lee, K., Chan, C. K., Patil, N., Goodman, S. B. Cell therapy for bone regeneration-Bench to bedside. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 89, 252-25 (2009).
  4. Gaipa, G. GMP-based CD133+ cells isolation maintains progenitor angiogenic properties and enhances standardization in cardiovascular cell therapy. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14, 1619-1619 (2010).
  5. Trounson, A. New perspectives in human stem cell therapeutic research. BMC medicine. 7, 29-29 (2009).
  6. Mazhari, R., Hare, J. M. Mechanisms of action of mesenchymal stem cells in cardiac repair: potential influences on the cardiac stem cell niche. Nat Clin Pract Cardiovasc Med. 4, Suppl 1. S21-S21 (2007).
  7. Kimes, B. W., Brandt, B. L. Properties of a clonal muscle cell line from rat heart. Experimental Cell Research. 98, 367-367 (1976).
  8. Sardao, V. A. Vital imaging of H9c2 myoblasts exposed to tert-butylhydroperoxide--characterization of morphological features of cell death. BMC Cell Biol. 8, 11-11 (2007).
  9. Hescheler, J. Morphological, biochemical, and electrophysiological characterization of a clonal cell (H9c2) line from rat heart. Circulation research. 69, 1476-1476 (1991).
  10. Cselenyak, A. Mesenchymal stem cells rescue cardiomyoblasts from cell death in an in vitro ischemia model via direct cell-to-cell connections. BMC Cell Biol. 11, 29-29 (2010).
  11. Sauvant, C. Implementation of an in vitro model system for investigation of reperfusion damage after renal ischemia. Cell Physiol Biochem. 24, 567-567 (2009).
  12. Namas, R. A. Hypoxia-Induced Overexpression of BNIP3 is Not Dependent on Hypoxia-Inducible Factor 1alpha in Mouse Hepatocytes. Shock. 36, 196-196 (2011).
  13. Cao, L. Hypoxia/Reoxygenation Up-Regulated the Expression of Death Receptor 5 and Enhanced Apoptosis in Human Hepatocyte Line. Transplantation Proceedings. 38, 2207-2207 (2006).
  14. Meloni, B. P., Meade, A. J., Kitikomolsuk, D., Knuckey, N. W. Characterisation of neuronal cell death in acute and delayed in vitro ischemia (oxygen-glucose deprivation) models. Journal of Neuroscience Methods. 195, 67-67 (2011).
  15. Mimeault, M., Hauke, R., Batra, S. K. Stem cells: a revolution in therapeutics--recent advances in stem cell biology and their therapeutic applications in regenerative medicine and cancer therapies. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 82, 252-252 (2007).
  16. Angoulvant, D. Mesenchymal stem cell conditioned media attenuates in vitro and ex vivo myocardial reperfusion injury. J Heart Lung Transplant. 30, 95-95 (2010).
  17. Lim, Y. J., Zheng, S., Zuo, Z. Morphine Preconditions Purkinje Cells against Cell Death under In Vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Conditions. Anesthesiology. 100, 562-562 (2004).
  18. Guo, J. Estrogen-receptor-mediated protection of cerebral endothelial cell viability and mitochondrial function after ischemic insult in vitro. J Cereb Blood Flow Metab. 30, 545-545 (2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

H9c2

Похожие статьи