Мы показываем, как препарировать и культуре куриных Е4 statoacoustic ганглия и E6 спинного эксплантов мозга. Эксплантов культивируют в бессывороточной условия в 3D гели коллагена в течение 24 часов. Нейритов отзывчивость тестируется с фактором роста дополнена средой и с белком покрытием бисером.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Разбор и культуры Чик Statoacoustic ганглия и спинного мозга при эксплантов Коллаген Гели для нейритов Анализы вырост
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Органов чувств куриного внутреннего уха иннервируются периферических процессов statoacoustic ганглий (SAG) нейронов. Сенсорная иннервация органа зависит от сочетания аксон руководством сигналы 1 и 2 факторов выживания, расположенных вдоль траектории растущих аксонов и / или в рамках своей цели сенсорных органов. Например, функциональные вмешательство в классический аксон руководством сигнального пути, semaphorin-neuropilin, генерируемых misrouting из ушной аксонов 3. Кроме того, некоторые факторы роста, выраженный в сенсорных целей внутреннего уха, в том числе нейротрофина-3 (NT-3) и производные мозга нейротрофический фактор (BDNF), были изменены в трансгенных животных, опять же ведет к misrouting СА аксонов 4. Эти же молекулы способствующие выживанию и аксонов нейронов куриных SAG в пробирке 5,6.
Здесь мы описываем и продемонстрировать в пробирке методом мы в настоящее время упеть проверить отзывчивость нейритов куриных SAG в растворимые белки, в том числе известные морфогенов таких как Wnts, а также факторы роста, которые имеют важное значение для содействия SAG результатом аксонов и нейронов выживания. Используя эту модель системы, мы надеемся сделать выводы об эффектах, которые выделяются лигандов может оказывать на SAG выживанию нейронов и аксонов.
SAG эксплантов расчленены на 4-й день эмбрионального (Е4) и культивировали в трехмерном гели коллагена под бессывороточной условиях в течение 24 часов. Во-первых, нейритов отзывчивость проверяется при культивировании эксплантов с белком-добавляемой среде. Затем, чтобы спросить, есть ли точечных источников выделяется лиганды могут иметь направленного воздействия на аксонов, эксплантаты являются со-культивировали с белком покрытые бисером и анализировали на способность борта к локально способствовать или препятствовать нарост. Мы также включаем демонстрации вскрытия (модифицированный протокол 7) и культуры E6 спинного эксплантов мозга. Мыобычно используют спинного эксплантов шнур для подтверждения биологической активности белков и белковых пропитанной бисера, а также для проверки видов перекрестной реактивности с куриных ткани, в тех же условиях культуры как SAG эксплантов. Эти тесты в пробирке удобны для быстрого скрининга молекул, которые оказывают трофические (выживание) или тропического (по направлению) воздействие на нейроны SAG, особенно перед проведением исследования в естественных условиях. Более того, этот метод позволяет испытания отдельных молекул под бессывороточной условиях, с высокой выживаемости нейронов 8.
Протокол
Рецепты
Чик Ringers
| 7,2 г | NaCl |
| 0,23 г | CaCl 2 + 2H 2 O |
| 0,37 г | KCl |
| 0,115 г | Na 2 HPO 4 |
| 900 мл | Вода (степень культуры ткани) |
Примечание: Регулировка рН до 7,4. Принесите конечный объем до 1000 мл воды.
10X PBS
| 40 г | NaCl |
| 1 г | KCl |
| 7 г | Na 2 HPO 4 |
| 1,2 г | KH 2 PO 4 |
| 450 мл | DEPC воды |
Примечание: Регулировка рН до 7,4. Доведите окончательноеобъем до 500 мл водой. Рабочие концентрации (1X) производится путем разбавления 1 часть 10X акции с 9 частями ткани культуры сорт воды, как, например, полученные с Millipore системы УФ-излучение для получения воды с 18 МОм-см проводимость.
SAG эксплантов проведения среда
- DMEM/F12 с L-глутамина, 10 мМ Hepes
- 10% инсулина, передача, селен (ИТС +1)
- 1% перо-стрептококк
Эксплантов культуральной среде
- SAG эксплантов проведения среда
- 10 нг / мл нейротрофина-3 (NT-3)
- 10 нг / мл цилиарной нейротрофический фактор (CNTF)
Спинной мозг и рассечение проведения среда
- L-15
- 10% эмбриональной телячьей сыворотки
- 1% перо-стрептококк
Инкубировать яйца при 37-38 ° С. Стерилизовать рассекает инструменты и Sylgard рассекает блюдо в 70% этанола. Пройдя через посуду и инструменты могут быть также УФ стерилизовать в одночасье.
1. Бусы подготовки
- Место бусины микропробирок с 1 мл стерильной PBS, перемешайте и подождите, пока бусы оседают на дне пробирки.
- Вымойте бисером несколько раз, удаляя супернатант после бисером поселились и ресуспендируют в PBS.
- Инкубируйте бусины очищенного белка (разводят в PBS) или PBS в одиночку (контроля) в течение 1 часа при комнатной температуре.
- Промыть бусин в ФБР и хранить в 24-луночного планшета с 1 мл PBS, пока размещены в коллаген.
2. Statoacoustic рассечение ганглий
- На Е4 удалить эмбрион из яйцеклетки и поместить его в блюдо с раствором куриного Рингера для удаления зародышевых оболочек.
- Место эмбриона в Sylgard © выстроились Петри заполнена холодным HBSS и положение эмбриона на бок слухового пузыря вверх. Pin эмбриона блюдо использованием рассекает булавки.
- Использование двух рассекает контакты, сделать горизонтальный разрез через кожу сразу вентральнееканал сумки, примерно там, где он отвечает улиткового канала. Сделайте вертикальный разрез передней и задней, чтобы SAG. Используйте пинцет или рассекает булавку, чтобы поднять и удалить лоскут кожи граничит с тремя разрезами.
Примечание: SAG находится на краю антеровентральном отоцист, примерно на полпути между спинной сумке которого хорошо видна с подсветкой базы светлое, и вентральной улиткового канала, какие проекты ventromedially и заслоняется глотки арок. Улиткового канала удлиняется так что его дорсовентральной размер будет постепенно увеличиваться на Е4 между Гамбургер-Гамильтона этапы 23-25 9.
- Потяните отоцист в заднем направлении, чтобы отделить его от SAG. Свернуть тканей, окружающих SAG с рассечением штифты и осторожно снимите SAG из эмбриона с помощью # 55 щипцами. Удалите большие куски мезенхимальных тканей и нервных пучков выступающие от SAG.
- Использование широким горлом кончика пипетки, передача эксплантов для24-луночный планшет с 0,5 мл SAG эксплантов проведение среды. Держите эксплантов на льду или при комнатной температуре в течение 4 часов.
3. Спинной рассечение шнур
- Удалить E6 эмбриона из яйцеклетки и поместить его в блюдо с раствором куриного Рингера. Удалите головы и зародышевых оболочек.
- Место тела в Sylgard © рассекает блюдо с холодной средой рассечение спинного мозга. Положение и контактный эмбриона "вентральный вниз" и хвостового стоящих перед экспериментатором. Место вскрытия булавки каждой конечности и через передний конец.
- Использование щипцов и / или рассекает булавки, осторожно снимите кожу и ткани, двигаясь в направлении вентральной, пока дорсальной поверхности спинного мозга видна.
- Отрежьте спинной средней линии спинной мозг с рассекает контактный, в задней к передней, вдоль всей длины спинного мозга. Это создает "открытая книга", как левая и правая стороны спинного мозга отдельно.
- Удалить окружающие ткани, с боков, чтобы изолировать спинного мозга и подвергать спинной ганглий корня (DRG). Удалить DRG и мозговых оболочек, потерев рассекает булавкой или пинцетом между спинным мозгом и DRG.
- Удалить спинной мозг из организма, удерживая хвостового-самый конец спинного мозга пинцетом и поднимая вверх и в сторону от экспериментатора. Удалите оставшиеся DRG и мозговых оболочек.
- Держите один конец спинного мозга с пинцетом (или контактный его в блюдо) и использовать Vannas ножницы, чтобы разрезать вдоль вентральной средней линии, чтобы делить пополам спинного мозга.
- Держите один конец эксплантов щипцами для иммобилизации ткани и использовать Vannas ножницы, чтобы вырезать небольшие эксплантов (100-500 мкм в длину) по всей длине ткани. Плиты перекрытия могут быть признаны ясно утолщения ткани вдоль одной эксплантов края.
- Используйте широкий рот кончик пипетки для передачи эксплантов в 24-луночный планшет с 0,5 мл холодной среды рассечение. Держите эксплантов на льду для поддержания жизнеспособности тканей, еили до 4 часов.
4. Эксплантов культуры с очищенных белков для проверки нейритов отзывчивость
- Подготовка 1,5 мг / мл раствора коллагена в 15 мл коническую трубку, на льду, в соответствии с инструкциями производителя.
- Проверьте коллагена решение имеет рН 7-7.4 использованием индикаторной бумаги рН. Отрегулируйте рН путем добавления NaOH в 1 мкл.
- Передача эксплантов для 24-луночного планшета, используя широкий кончик пипетки ртом и аспирата лишнюю жидкость. Несколько эксплантов можно культивировать в одной скважине, но должно быть как минимум 500 мкм друг от друга.
- Добавить 0,5 мл коллагена и содержащих эксплантов. Позиция эксплантов на нижней поверхности скважины. Не забудьте настроить каждую культуру полностью, прежде чем перейти к следующему хорошо, потому что коллаген начнет полимеризоваться при комнатной температуре.
- Место культуры пластины на 37 ° С теплее слайд в течение 30-45 мин для полимеризации коллагена. Когда коллаген polymerized она будет напоминать гель.
- Добавить 0,5 мл теплой питательной среды эксплантатов дополнены или очищенных белков (разводят в PBS) или PBS (контроль) и инкубировать при температуре 37 ° C, 5% СО 2. Влияние на аксонов должен быть виден на 24 часа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы использовали тот же протокол для эксплантов культуры SAG до 42 часов.
5. Эксплантов совместной культуре с белком покрытием бисером проверить результат направленного нейритов
- Начните с эксплантов шаги культуры 4.1-4.4.
- С помощью пипетки, передача 1-5 бусы из PBS к колодцу, содержащей решение коллагена и эксплантов.
- Используйте пинцет, чтобы положение бусин 50-500 мкм от края эксплантов.
- Место пластины на 37 ° С теплее слайд в течение 30-45 мин для полимеризации коллагена. Ткани или бисер может стать, перемещенных в коллаген полимеризуется. Проверьте культур и повторно позиции ткани и бисера в течение первых 5 мин.
- Добавить 0,5 мл SAG средств массовой информации в каждую лунку и инкубировать в течение 24 часов.
6. Визуализация аксонов по иммуногистохимии
- Промыть культур в PBS и исправить в течение 1 часа при комнатной температуре в 4% параформальдегида в ФСБ.
- Выпуск гели от стен скважины с помощью трассировки по краю гели с закругленным концом лопаточки тефлоновой микро. Выполните immunostain с гелей в скважинах. Промойте несколько раз в PBS.
- Инкубируйте в 0,5 мл блокирующий раствор (10% телячьей сыворотки, 0,1% Triton X-100, 0,1% азида натрия в PBS) в течение ночи при 4 ° C.
- Инкубируйте в 0,5 мл первичного антитела (анти-β-тубулина антителами разбавленной 1:500 в блокировании решения) в течение ночи при 4 ° C.
- Промойте несколько раз в PBS. Инкубируйте в 0,5 мл вторичного антитела (Alexa Fluor 488 антимышиного IgG антител 2b разбавленной 1:500) в течение ночи при 4 ° C. С этого шаг вперед, держать пластины в темных или заверните в фольгу, из-за светочувствительностьвторичные антитела.
- Промойте несколько раз в PBS и хранить при температуре 4 ° С в PBS на срок до одной недели.
7. Представитель Результаты
Рисунок 1. Представитель результаты нейритов способствующих эффект очищенного NT-3 и NT-3-покрытием бусины на эксплантаты Е4 куриных SAG. SAG нейронов клеточных тел и невриты были immunostained с β-тубулина и полученную с 10-кратным цели по конфокальной микроскопии. После 24 часов в пробирке, SAG эксплантов отображается больше аксонов в присутствии 100 нг / мл очищенной человека NT-3 добавляли в среду клеточной культуры (1B), по сравнению с контрольной группой (1А). SAG нейроны со-культурный бисером пропитанной in100 нг / мл NT-3, чтобы продемонстрировать, что точечный источник NT-3 может локально способствовать аксонов. Эксплантов отображается дольше и плотнее аксонов на сторонеэксплантов сталкивается шарик по сравнению с противоположной стороны (1D) и по сравнению с контрольными культурами бисером пропитанные PBS (1С). Шкала бар = 200 мкм.
Рисунок 2. Представитель результаты нейритов способствующих эффект очищенного Wnt5a и Wnt5a покрытием бусины на E6 куриных спинного мозга. Спинной эксплантов шнур были immunostained с β-тубулина и полученную с использованием конфокальной микроскопии. Через 24 часов роста в присутствии очищенной мыши Wnt5a (400ng/ml), аксонов из куриных спинного эксплантов шнур был увеличен (2B) по сравнению с контрольной культурный без Wnt5a (2А). Бисер пропитанную 500 нг / мл Wnt5a, размещенные 300-500 мкм от края спинного эксплантов мозга, также способствовало аксонов (2D) по сравнению с контрольными культурами (2C). Аналогичные побочные культура результаты ранее были опубликованы с Wnt5a-экспрессирующие клетки 8. Шкала бар = 200мкм.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Мы представляем метод препарировать и культуры E4 и E6 SAG спинного эксплантов мозга, от цыпленка, под бессывороточной условиях. Эта процедура в настоящее время используется в нашей лаборатории для изучения влияния различных выделяется лигандов на SAG выживанию нейронов и аксонов. Новые аспекты этого протокола включают в себя использование бессывороточной системы для культивирования эксплантатов и использование бисера пропитанные факторами роста для изучения воздействия на SAG результатом аксонов. Бусинка методом, анало...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Эта работа финансировалась Национальным институтом здоровья Грант RO1DC002756 и Purdue исследовательский фонд. Мы благодарим Дорис Ву Чанг и Визе за советом с экспериментами и Родни McPhail за помощью цифр.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Реагент | Компания | Номер по каталогу | Комментарий |
| Оборудование | |||
| Препарирование микроскопом | Мы используем Leica M80 стереомикроскопа с базой светлое освещение | ||
| Слайд теплее | CS & E. | Коллаген полимеризации | |
| Куриное яйцо инкубатор | |||
| 37 ° C / 5% CO 2 увлажненный культуре клеток инкубатор | |||
| Препарирование материалы | |||
| Sylgard &копию; покрытием чашке Петри | |||
| 24-а культура клеток пластины | Гранулирование | 3526 | |
| # 5 Дюмон щипцы | Инструменты изобразительных наук | 11252-30 | |
| # 55 Дюмон щипцы | Инструменты изобразительных наук | 11295-51 | |
| Нержавеющая сталь рассекает контакты | Инструменты изобразительных наук | 26002-10 | Эмбрион пиннинга, тонкая вскрытия |
| Мория перфорированной ложкой | Инструменты изобразительных наук | 10370-17 | Эмбрион сбора / передачи |
| 200 мкл широкий советы пипетки рот | Dot Научно Inc | 118-96R | Эксплантов передачи |
| Е4 и яйца куриные E6 | NB &зр; | ||
| Чик раствор Рингера | Эмбрион урожая | ||
| HBSS | Сигма | H8264 | SAG вскрытия |
| L15 среда | Сигма | L5520 | Спинной среду рассечение шнур |
| Фетальной телячьей сыворотки | Атланты биологические препараты | S11150 | Спинной среду рассечение шнур |
| Vannas Ножницы | Инструменты Всемирной Precision | 501778 | Спинной рассечение шнур |
| Коллаген подготовки | |||
| Крыса хвостом коллагена I типа | BD Biosciences | 354249 | Эксплантов культуры |
| 10X PBS (стерильная) | Для нейтроновtralize коллагена | ||
| 1N NaOH (стерильная) | Для нейтрализации коллагена | ||
| Дистиллированной воды (стерильная) | Для нейтрализации коллагена | ||
| рН индикатор работы (6.0-8.1) | Ватман | 2629-990 | Для проверки коллагеновой рН |
| 15 мл конические пробирки | Dot Научно Inc | 818-ПГ | |
| 500 мкл широкий советы пипетки рот | Dot Научно Inc | 119-R100 | Для пипетки коллагена |
| Эксплантов культуры | |||
| DMEM/F12 среда | Сигма | D8437 | Эксплантов культуральной среде |
| ЕЕ +1 | Сигма | I2521 | Средний дополнения |
| Пенициллин-Стрептомицин | Invitrogen | 15140-122 | Средний дополнения |
| CNTF (крыса) | Сигма | C3835 | Средний дополнения |
| NT-3 (человек) | Сигма | N1905 | Средний дополнения |
| Очищенная мыши Wnt5a | R & D Systems | 645-WN-010 | |
| Аффи-гель бисер Синий гель | Bio-Rad | 153-7302 | |
| Иммуногистохимия | |||
| Параформальдегид | Сигма | P6148 | Фиксация |
| PBS | Промывка | ||
| Тритон Х-100 | Сигма | T9284 | Блокировка решение |
| НатрийАзид | Сигма | S8032 | Блокировка решение |
| Телячьей сыворотки | Invitrogen | 16170-078 | Блокировка решение |
| Мышь моноклональных IgG2b анти-β тубулина 1 + II антител | Сигма | T8535 | Этикетки клеточных тел и невриты |
| Alexa Fluor 488 антимышиного IgG2 б антител | Invitrogen | A21141 | Обнаружение антител β тубулина |
| Тефлон микро шпателем | VWR | 57949-033 | Выпуск коллагена гели из хорошо |
Ссылки
- Fekete, D. M., Campero, A. M. Axon guidance in the inner ear. Int. J. Dev. Biol. 51 (6-7), 549-549 (2007).
- Fritzsch, B. Development of inner ear afferent connections: forming primary neurons and connecting them to the developing sensory epithelia. Brain Res. Bull. 60 (5-6), 423-423 (2003).
- Gu, C. Neuropilin-1 conveys semaphorin and VEGF signaling during neural and cardiovascular development. Dev. Cell. 5 (1), 45-45 (2003).
- Tessarollo, L., Coppola, V., Fritzsch, B. NT-3 replacement with brain-derived neurotrophic factor redirects vestibular nerve fibers to the cochlea. J. Neurosci. 24 (10), 2575-2575 (2004).
- Avila, M. A. Brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 support the survival and neuritogenesis response of developing cochleovestibular ganglion neurons. Dev. Biol. 159 (1), 266-266 (1993).
- Bianchi, L. M., Cohan, C. S. Effects of the neurotrophins and CNTF on developing statoacoustic neurons: comparison with an otocyst-derived factor. Dev. Biol. 159 (1), 353-353 (1993).
- Juurlink, B. ernhardH. J. Chick Spinal Somatic Motoneurons in Culture. Protocols for Neural Cell Culture.. 59, (2001).
- Fantetti, K. N., Zou, Y., Fekete, D. M. Wnts and Wnt inhibitors do not influence axon outgrowth from chicken statoacoustic ganglion neurons. Hear. Res. , (2011).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-49 (1951).
- Bourikas, D. Sonic hedgehog guides commissural axons along the longitudinal axis of the spinal cord. Nat. Neurosci. 8 (3), 297-297 (2005).
- Charron, F., Tessier-Lavigne, M. Novel brain wiring functions for classical morphogens: a role as graded positional cues in axon guidance. Development. 132 (10), 2251-2251 (2005).
- Augsburger, A. BMPs as mediators of roof plate repulsion of commissural neurons. Neuron. 24 (1), 127-127 (1999).
- Lyuksyutova, A. I. Anterior-posterior guidance of commissural axons by Wnt-frizzled signaling. Science. 302 (5652), 1984-1984 (2003).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
