$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Эукариотическая клетка опирается на сложные, высоко регулируемые и функционально отличные мембранные компартменты, которые сохраняют биохимическую полярность, необходимую для правильного функционирования клетки. Поэтому понимание того, как ферменты, белки и компоненты цитоскелета управляют и поддерживают эту биохимическую сегрегацию, имеет первостепенное значение. Использование флуоресцентно помеченных молекул для локализации и/или возмущения субклеточных компартментов дало богатые знания и углубило наше понимание клеточной регуляции. Методы визуализации, такие как флуоресцентная и конфокальная микроскопия, делают определение положения флуоресцентно помеченной малой молекулы относительно простым, однако разрешение очень маленьких структур ограничено.
С другой стороны, электронная микроскопия выявила детали субклеточной морфологии с очень высоким разрешением, но ее статическая природа затрудняет измерение высокодинамичных процессов с точностью 2,3. Таким образом, комбинация световой микроскопии с электронной микроскопией одного и того же образца, называемая корреляционной световой и электронной микроскопией (CLEM) 4,5, дает двойные преимущества сверхбыстрой флуоресцентной визуализации с высоким разрешением электронной микроскопии6. Эта мощная методика была применена для изучения многих аспектов клеточной биологии 5,7. С момента своего появления эта процедура расширила нашу способность различать субклеточные архитектуры и морфологии с высоким разрешением.
Здесь мы представляем оптимизированный метод выполнения быстрого микровпрыска с последующим CLEM (рис. 1). Процедура микроинъекции CLEM может быть использована для введения определенных количеств малых молекул и/или белков непосредственно в цитоплазму эукариотической клетки и изучения эффектов от миллиметрового до многонанометрового разрешения (рис. 2). Метод основан на микроинъекции клеток, выращенных на покровных стеклах с лазерной гравировкой, прикрепленных к дну чашек с живыми клетками, и визуализации с помощью конфокальной флуоресцентной и электронной микроскопии. Локализация интересующей клетки (клеток) облегчается сетчатым рисунком, который легко переносится вместе с представляющими интерес клетками на эпоновую смолу, используемую для иммобилизации образцов и среза перед анализом с помощью электронной микроскопии (рис. 3). Наложение флуоресцентных и электромагнитных изображений позволяет пользователю определить субклеточную локализацию, а также любые морфологические и/или ультраструктурные изменения, вызванные исследуемой микроинъецируемой молекулой (рис. 4). Этот метод поддается воздействию временных интервалов от ≤5 с до нескольких часов, в зависимости от характера микроинъецируемого образца.