Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Immunohistological Маркировка микротрубочек в Сенсорные дендритов нейронов, трахеи, и мышцы в Drosophila Личинка стенки тела

12K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/3662

⸱

10 ноября 2011 г.

 ,  , 
1Disease Mechanism Research Core, RIKEN Brain Science Institute, 2Graduate School of Science and Engineering, Saitama University

В этой статье

Краткое содержание

Чтобы понять, как сложные формы клеток, например, нейронных дендритов, достигаются в процессе развития, важно, чтобы быть в состоянии точно организации микротрубочек анализа. Здесь мы опишем надежной immunohistological метод маркировки для изучения организации микротрубочек дендритных разветвление дендритов нейронов сенсорных, трахея, мышцы и другие Drosophila Личинка тканей стенки тела.

Аннотация

Чтобы понять, как различия в сложной формы ячейки достигнута, важно точно следовать микротрубочек организации. Тела дрозофилы личиночной стены состоит из нескольких типов клеток, которые являются моделями для изучения клеток и тканей морфогенеза. Например трахеи используются для изучения морфогенеза трубки 1, и дендритные разветвление (DA) сенсорных нейронов личинки дрозофилы стали основной системы для выяснения общих и нейрон-класс-специфические механизмы дендритных 2-5 дифференциация и перерождение 6 .

Форма дендритов ветви могут существенно различаться между нейроном классы, и даже между различными ветвями одного нейрона 7,8. Генетические исследования в нейронах Д. А. предполагают, что дифференциальные цитоскелета организация может лежать в основе морфологических различий в дендритные формы филиала 4,9-11. Мы обеспечиваем надежный метод маркировки для иммунологическихssay в естественных условиях микротрубочек организации в Д.А. сенсорного нейрона дендритов беседки (рис. 1, 2, фильм 1). Этот протокол иллюстрирует вскрытие и иммунной первой взрослой личинки, этап, когда активной сенсорной вырост дендрита нейрона и ветвление организации происходит 12,13.

В дополнение к окрашиванию сенсорных нейронов, этот метод позволяет достичь надежной маркировки организации микротрубочек в мышцах (Видео 2, 3), трахеи (рис. 3, Movie 3), и других тканей стенки тела. Он ценен для следователей желающих анализировать микротрубочек организации на местах в стенке тела при исследовании механизмов, ткани контроля и формы клеток.

Протокол

1. Подготовка реагентов

Примечания Перед началом: Разбор и иммуногистохимического окрашивания осуществляется в магнитных камеры и личинка возлагали вниз, используя специальную форму контакта насекомого. Подробные инструкции по строительству магнитной камеры, и подготовка этих выводов можно найти в соответствующих ссылок 14,15. Короче говоря, отверстие 1x1cm квадратных разрезается на магнитных листа и покровного прикреплена к задней части листа, чтобы сделать небольшую камеру. Стенками камеры герметизированы эпоксидным клеем, после этого клей установил камеру несколько раз промывают 70% этанолом перед использованием. Препарирование контакты насекомых готовы, сгибая в нужную форму, а затем наклеиваются на металл вкладку 14,15. В качестве альтернативы металла вкладку, мы использовали перевернутый с плоской головкой стали канцелярская кнопка с ручкой из отсечки желтый наконечник. Использование этого магнитного расположения камеры позволяет тщательный контроль ОвеГ контактный позиционирования и растяжения тканей во время вскрытия.

Чтобы управлять экспрессией гена-репортера в различных подмножеств Д. А. следователи нейроны могут использовать несколько различных Gal4 линий (обобщены Шимоном и его коллеги 16). Многие из этих линий можно получить в общественных центрах акций. В этом представительном протокол, мы осуществляем иммунной линии, в которых два противоположных класса DA нейрона совместно называются: самый простой класс я и самый сложный класс IV (P10-Gal4 17,18, UAS-mCD8:: Kusabira-оранжевый (КО)).

  1. Подготовка Ca + +-бесплатный HL3.1 солевой
    1. В мм: 70 NaCl, 5 KCl, 20 MgCl 2, 10 NaHCO 3, 5 HEPES, 115 сахарозы и 5 трегалозу; рН 7,2 19. Фильтр-стерилизовать и хранить при температуре 4 ° C. Примечание: Ca + +-бесплатное решение предотвращает сокращение мышц во время вскрытия.
  2. Подготовка 2x буфера PHEM
    1. В мм: 130 ТРУБЫ, 60 HEPES, 20 EGTA, 4 MgSO4, рН 7,0. Фильтр-стерилизовать и хранить при температуре 4 ° C.

      Примечание: Эти материалы не растворяются, пока рН подходы 7.0.

  3. Подготовка фиксирующие только что непосредственно перед фиксацией.
    1. Для того чтобы подготовить 25 мл раствора, первый параформальдегида 2g смеси, 100 мкл 1М NaOH и 10 мл воды в 50 мл трубки Falcon.
    2. Встряхните фиксатором в 55 ° С водяной бане с шейкер, пока раствор не станет прозрачным. (Общий объем составит около 11,5 мл.)
    3. Прохладный фиксатором на льду.
    4. Добавить 12.5ml 2x буфера PHEM.
    5. Отрегулируйте рН до 7,0 с помощью 1М HCl.
    6. Заполните раствор водой до объема 25 мл.
    7. Фильтры решения с использованием ватмана.

2. Личинки вскрытия

Обратите внимание, перед началом: микротрубочек сетей, и особенно те, в сенсорных дендритов, будет пробой быстро после начала вскрытия. Переменный токhieving быстрого вскрытия менее чем за пять минут с последующей немедленной фиксации являются ключевыми факторами в успехе этого протокола.

  1. Вымойте личинки в воде и быстро переместить их в это падение, используя цикл волос.
  2. Восток личинки спинной стороной вверх и брюшной стороны на стекле. Примечание: Это направление заключается в изучении нейронов вентральной кластера. Изучить спинной нейронов кластера, инвертировать ориентации.
  3. Использование центра насекомых-контактный к контакту переднем конце близ устья крючков. Место контактный близко к концу для лучшего результата.
  4. Место каплю физиологического раствора в HL3.1 вскрытия камеры.
  5. Вырезать очень заднего конца личинки прочь с microscissors. Примечание: Этот шаг открывает отверстие на заднем конце тела личинки, которая позволит доступ для microscissors (шаг 2.7).
  6. Захватите с пинцетом области кишечника, который сейчас торчат из диафрагмы на заднем конце личинки. Аккуратно вытащить весь кишечник.
  7. Местокончика одного лезвия microscissors через диафрагму и разрезать вдоль вентральной срединной линии по отношению к передней.
  8. Использование угол контакта, контакт теперь свободна углов, задних, а затем передние. Одновременно мягко растянуть открытых личиночной филе.

3. Фиксация, блокирование, окрашивания и монтажа личинок филе

Примечания Перед началом: Все фиксации и окрашивания шаги осуществляются в рассечение камеры. Во время этого процесса, будьте осторожны, чтобы не сбить насекомое контакты проведения личинки так как это может привести к повреждению тканей. Чтобы предотвратить эксперимент от высыхания, все делайте окрашивание шаги в небольшой контейнер Tupperware окружении смоченной ткани.

  1. Аспирируйте Ca + +-бесплатный HL3.1 буфер, используя желтый наконечник. Сразу же добавить фиксатор с использованием другого pipetteman.
  2. Аккуратно пипетку вверх и вниз, смешать с фиксатором оставшиеся следы Ca + +-бесплатный HL3.1 буферв камере. Сразу аспирата, а затем добавить свежий фиксатором в камеру.
  3. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 20 минут.
  4. Вымойте 6x 10 минут в PBST (0,1% Тритон Х-100 в PBS).
  5. Блок с 5% сыворотки козьего в PBST в течение 20 мин при комнатной температуре.
  6. Замените блокирующий раствор с первичными антителами разводят в 5% сыворотки козьего в PBST. Первичных антител использовали с помощью мыши анти-α-тубулина (DM1A) и крысы анти-CD8 (5H10), как разбавленный 1 / 1000.

    Примечание: следователь, возможно, пожелают заменить мышь анти-α-тубулина (DM1A) с мышью против Futsch (22C10) 20,21 разбавленного 1 / 1000 в некоторых обстоятельствах (см. обсуждение).

  7. Выдержите в течение ночи (по крайней мере 16 ч) при 4 ° C.
  8. Вымойте 6x 10 минут в PBST.
  9. Добавить вторичных решение антител разводят в 5% сыворотки козьего в PBST. Вторичные антитела, используемые Alexa Fluor 488 антимышиного IgG и Cy3 осла анти-IgG крысы. Держите выборка охватывала для предотвращения флуорофорафото-отбеливание 22.
  10. Инкубируйте либо при комнатной температуре в течение двух часов или на ночь при 4 ° C следует один час при комнатной температуре.
  11. Вымойте 6x 10 минут в PBST.
  12. Место личиночной филе на слайде кутикулы стороной вниз, смонтировать в 80% глицерина, и печатью сторон покровным лаком для ногтей для 'быстрый' горе.
    Примечание: Для улучшения очистки ткани, и постоянный стабильный образец, смонтировать в DPX, как описано выше 23.

4. Представитель Результаты:

Флуоресцентные окрашивание рассматривается в соответствии с конфокальной микроскопии. На рисунках 1-2, различных отраслей в дендритных беседки имеют различные цитоскелета организации. На рисунке 1 показана область вала IV класса DA нейронов на 1-м этапе личиночного возраста. Вся беседка отмечен mCD8:: KO и регистрируется с помощью анти-CD8 антител и флуоресцентного вторичные (Cy3). Тубулина определяется с помощью анти α-тубулина антител и фторescent вторичные (Alexa Fluor 488). Основные отрасли являются позитивными для тубулина, некоторые тонкие ветки стороне тубулина-отрицательными. Фильм 1 представляет собой набор серийных срезов через аналогичный окрашивание класса я Д. А. нейрона. На рисунке 2 показана область вала IV класса DA нейронов окрашивали антителами против Futsch и CD8 на 1-м этапе личиночного возраста. Основные отрасли Futsch-инфицированным, некоторые тонкие ветки стороне Futsch-отрицательными. Рисунок 3. Трахеи в личиночной стенкой тела показывают сложную организацию микротрубочек. Фильмы 2 и 3 показаны серийные участки окрашивания через стенки тела мышцы и трахеи.

figure-protocol-1
Рисунок 1. Рис. 1 показана область вала IV класса DA нейронов на 1-м этапе личиночного возраста. Вся беседка отмечен mCD8:: KO и регистрируется с помощью анти-CD8 антител и флуоресцентного вторичные (Cy3). Тубулина определяется с помощью анти-и-Tubuliн антитела и флуоресцентные вторичные (Alexa 488). Панели переменного тока последовательного конфокальной Z-секций (0.5μm), С ^-С ", одного меченых антител с панели C. Пример ветви с (желтые стрелки) или без (фиолетовая стрелка) микротрубочки выделены. Красной выделить наконечники стрел микротрубочек в основной эпителиальных клеток.

figure-protocol-2
Рисунок 2. Рис. 2 показаны аналогичные область беседке класса IV да нейрона окрашивали антителами против Futsch и CD8 на 1-м этапе личиночного возраста. Вся беседка отмечен mCD8:: KO и регистрируется с помощью анти-CD8 антител и флуоресцентного вторичные (Cy3). Futsch определяется с помощью анти-Futsch антитела и флуоресцентные вторичные (Alexa 488). Основные отрасли Futsch-инфицированным, некоторые тонкие ветки стороне Futsch-отрицательными. Пример ветви с (желтые стрелки) или без (фиолетовая стрелка) Futsch выделены.

figure-protocol-3
Рисунок 3. Трахея окрашивали анти-тубулина протокол, описанный выше. Это личинка третьего возраста и расчлененным, как описано выше 23,24. Movie 3 показан увеличенный серийных срезов с поля отмечены площади.

Фильм 1. Последовательный разделов трассировки тубулина окрашивания всей дендритных беседки из класса я нейрона. Вся беседка отмечен mCD8:: KO (Magenta) и регистрируется с помощью анти-CD8 антител и флуоресцентного вторичные (Cy3). Тубулина (зеленый) определяется с помощью анти-α-тубулина антитела и флуоресцентные вторичные (Alexa Fluor 488). Масштаб: с одной стороны видеоизображения соответствует 46.88μm в разделе. Щелкните здесь для просмотра фильмов.

Фильм 2. Последовательный разделов трассировки тубулина окрашивания в совет директорову стены мышцы третьего взрослой личинки. Тубулина определяется с помощью анти-α-тубулина антитела и флуоресцентные вторичные (Alexa Fluor 488). Масштаб: с одной стороны видеоизображения соответствует 46.88μm в разделе. Щелкните здесь для просмотра фильмов.

Фильм 3. Последовательный разделов трассировки тубулина окрашивания в стенке тела трахеи третьей взрослой личинки, отмеченные площади рис.3. Тубулина определяется с помощью анти-α-тубулина антитела и флуоресцентные вторичные (Alexa Fluor 488). Масштаб: с одной стороны видеоизображения соответствует 46.88μm в разделе. Щелкните здесь для просмотра фильмов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Чтобы понять, как клеточный комплекс форм достигается очень важно быть в состоянии точно организации микротрубочек анализа. Здесь мы опишем надежной immunohistological метод маркировки для анализа организации микротрубочек дендритных разветвление нейрона сенсорными дендритов. В дополнение к окрашиванию сенсорных нейронов, этот метод позволяет достичь надежной immunohistological окрашивание трахея, мышцы и другие ткани стенки тела.

Мы используем этот протокол для изучения организации микротру...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим RIKEN для финансирования. P10-Gal4 был своего рода подарок Алена Винсент (Университет Поля Сабатье, Тулуза, Франция).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Название реагента Компания Каталог
номер 		Комментарии
(Опционально)
Щипцы Дюмон 11251-20
Microscissors FST 15000-08
Мышь анти-α-тубулина (Клон: DM1A) Сигма T9026 Разбавление 1 / 1000
Мышь против Futsch (Клон: 22C10),
супернатант 		Развивающие
Исследования
Гибридома банка 		22C10 Разбавление 1 / 1000
Крыса анти-CD8 (Клон: 5H10) Caltag MCD0800 Разбавление 1 / 1000
Alexa Fluor 488 анти-мышиных IgG Invitrogen -11001 Разбавление 1 / 500
Cy3 анти-IgG крысы Джексон Immunoresearch 712-166-150 Разбавление 1 / 200

Ссылки

  1. Schottenfeld, J., Song, Y., Ghabrial, A. S. Tube continued: morphogenesis of the Drosophila tracheal system. Curr. Opin. Cell. Biol. 22, 633-639 (2010).
  2. Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila. Genes Dev. 13, 2549-2561 (1999).
  3. Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136, 1049-1061 (2009).
  4. Moore, A. W. Intrinsic mechanisms to define neuron class-specific dendrite arbor morphology. Cell. Adh. Migr. 2, 81-82 (2008).
  5. Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129, 2867-2878 (2002).
  6. Nishimura, Y. Selection of Behaviors and Segmental Coordination During Larval Locomotion Is Disrupted by Nuclear Polyglutamine Inclusions in a New Drosophila Huntington's Disease-Like Model. J. Neurogenet. 24, 194-206 (2010).
  7. Ramon y Cajal, S. Histology of the nervous system of man and vertebrates, 1995 translation. , Oxford University Press. (1911).
  8. London, M., Hausser, M. Dendritic computation. Annu. Rev. Neurosci. 28, 503-532 (2005).
  9. Jinushi-Nakao, S. Knot/Collier and cut control different aspects of dendrite cytoskeleton and synergize to define final arbor shape. Neuron. 56, 963-978 (2007).
  10. Li, W., Gao, F. B. Actin filament-stabilizing protein tropomyosin regulates the size of dendritic fields. J. Neurosci. 23, 6171-6175 (2003).
  11. Ye, B. Differential regulation of dendritic and axonal development by the novel Kruppel-like factor Dar1. J. Neurosci. 31, 3309-3319 (2011).
  12. Parrish, J. Z., Xu, P., Kim, C. C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. The microRNA bantam functions in epithelial cells to regulate scaling growth of dendrite arbors in drosophila sensory neurons. Neuron. 63, 788-802 (2009).
  13. Sugimura, K. Distinct developmental modes and lesion-induced reactions of dendrites of two classes of Drosophila sensory neurons. J. Neurosci. 23, 3752-3760 (2003).
  14. Budnik, V., Gorczyca, M., Prokop, A. Selected methods for the anatomical study of Drosophila embryonic and larval neuromuscular junctions. Int. Rev. Neurobiol. 75, 323-365 (2006).
  15. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Drosophila Protocols. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  16. Shimono, K. Multidendritic sensory neurons in the adult Drosophila abdomen: origins, dendritic morphology, and segment- and age-dependent programmed cell death. Neural. Dev. 4, 37-37 (2009).
  17. Colomb, S., Joly, W., Bonneaud, N., Maschat, F. A concerted action of Engrailed and Gooseberry-Neuro in neuroblast 6-4 is triggering the formation of embryonic posterior commissure bundles. PLoS One. 3, 2197-2197 (2008).
  18. Dubois, L. Collier transcription in a single Drosophila muscle lineage: the combinatorial control of muscle identity. Development. 134, 4347-4355 (2007).
  19. Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J Neurogenet. 18, 377-402 (2004).
  20. Hummel, T., Krukkert, K., Roos, J., Davis, G., Klambt, C. Drosophila Futsch/22C10 is a MAP1B-like protein required for dendritic and axonal development. Neuron. 26, 357-370 (2000).
  21. Zipursky, S. L., Venkatesh, T. R., Teplow, D. B., Benzer, S. Neuronal development in the Drosophila retina: monoclonal antibodies as molecular probes. Cell. 36, 15-26 (1984).
  22. Brent, J., Werner, K., McCabe, B. D. Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry. J. Vis. Exp. (25), e1108-e1108 (2009).
  23. Karim, M. R., Moore, A. W. Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics. J. Vis. Exp. (57), e3111-e3111 (2011).
  24. Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila Larval NMJ Dissection. J. Vis. Exp. (24), e1107-e1107 (2009).
  25. Tao, J., Rolls, M. M. Dendrites have a rapid program of injury-induced degeneration that is molecularly distinct from developmental pruning. J. Neurosci. 31, 5398-5405 (2011).
  26. Yamamoto, M., Ueda, R., Takahashi, K., Saigo, K., Uemura, T. Control of axonal sprouting and dendrite branching by the Nrg-Ank complex at the neuron-glia interface. Curr. Biol. 16, 1678-1683 (2006).
  27. Mattie, F. J. Directed microtubule growth, +TIPs, and kinesin-2 are required for uniform microtubule polarity in dendrites. Curr. Biol. 20, 2169-2177 (2010).
  28. Pawson, C., Eaton, B. A., Davis, G. W. Formin-dependent synaptic growth: evidence that Dlar signals via Diaphanous to modulate synaptic actin and dynamic pioneer microtubules. J. Neurosci. 28, 11111-11123 (2008).
  29. Williams, D. W., Tyrer, M., Shepherd, D. Tau and tau reporters disrupt central projections of sensory neurons in Drosophila. J. Comp. Neurol. 428, 630-640 (2000).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Immunohistological Маркировка микротрубочек в Сенсорные дендритов нейронов, трахеи, и мышцы в Drosophila Личинка стенки тела
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.