Количественные Визуализация Lineage конкретных Toll-подобный рецептор-опосредованной сигнализации в моноцитах и ​​дендритных клеток из малых образцов крови человека

Summary

Мы описываем использование технологии ImageStream ( Www.amnis.com), Который сочетает в себе количественные проточной цитометрии с одновременным высоким разрешением цифрового изображения, количественно клеточных механизмов первичных иммунных клеток с четко определенной когорты пациентов. Наши исследования дают основой для поступательного исследования количественного линии специфический клеточный ответ в небольших образцов от субъекта когорт.

Abstract

Индивидуальные различия в иммунном статусе определить ответ на инфекцию и способствовать тяжести заболевания и результатов. Старение связано с повышенной восприимчивостью к вирусным и бактериальным инфекциям и снижение реакции на вакцины с хорошо документированной снижение гуморального и клеточного иммунного ответа ^1,2. Недавно мы оценили эффект старения на Toll-подобных рецепторов (TLRs), ключевые компоненты иммунной системы, которые обнаруживают микробной инфекции и вызвать антимикробной защиты организма ответы ^3. В большой группе здоровых человеческих доноров, мы показали, что моноцитов в периферической крови пожилых снизились выражения и функции определенных TLRs ⁴ и аналогичного снижения уровня TLR и сигнальные реакции в дендритные клетки (ДК), антиген-представляющих клеток, которые являются ключевыми в Связь между врожденного и адаптивного иммунитета ^5. Мы показали, нарушение регуляции TLR3 в макрофагахд меньше, производство IFN по РС у пожилых доноров в ответ на инфицирование вирусом Западного Нила ^6,7.

Первостепенное значение для нашего понимания иммунитета и для терапевтического вмешательства является глубокое понимание специфических типов клеток отвечать на запросы и механизм (ы) сигнала. Традиционные исследования иммунного ответа посредством визуализации первичных элементов и съемки маркеры ячейки FACS или иммуноблот продвинули наше понимание существенно, однако, эти исследования, как правило, ограничены технически малым объемом образца доступны пациентам и неспособностью проводить сложные лабораторные методы на нескольких человеческих образцов. ImageStream сочетает в себе количественные проточной цитометрии с одновременным высоким разрешением цифрового изображения и таким образом облегчает исследование в нескольких клеточных популяций одновременно для эффективного захвата пациента восприимчивости. Здесь мы демонстрируем использование ImageStream в ДК оценить TLR7 / 8опосредованной активации увеличение фосфорилирования и ядерной транслокации ключевым фактором транскрипции NF-kB, который инициирует транскрипцию множества генов, которые имеют важное значение для иммунной реакции ^8. Используя эту технологию, мы также недавно продемонстрировали ранее не изменение TLR5 сигнализации и NF-kB в моноцитах путь от старых доноров, которые могут способствовать измененной иммунологической реактивности при старении ^9.

Protocol

1. Выделение и стимуляция иммунных клеток

1. Получить 10-50 мл гепаринизированной крови здоровых добровольцев после письменного информированного согласия в соответствии с руководящими принципами местного Экспертный совет организации. Для изучения старения и патогенезе заболевания, исключение и включение критериев для каждого добровольца или пациент должен быть явно определен.
2. Изолировать человека мононуклеарных клеток периферической крови (МНПК) с помощью СРТ труб или Ficoll-Paque Plus в соответствии с инструкциями производителя (GE Healthcare, Нью-Джерси) и проводить эксперименты в день изоляции ⁷ (реагенты, таблица 1). ....

Discussion

Критические шаги в использовании ImageStream для поступательного исследования выбор соответствующих групп сравнения и оптимизации и проверки антител специфику. Различия между группами в теме помечены цель будет очевидным через гистограммы и клеточных изображений. В сочетании с тщательным анализом изменений в соответствующие рецепторы и сигнальные пути, эти данные будут предоставлять ценную информацию о механизмах, лежащих в основе иммунной регуляции в специализированных группах. Техника будет ограничено наличием специфи.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер по каталогу
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-03
R848	Invivogen	tlrl-r848
Параформальдегид (16%)	Электронная микроскопия наук	15710
BD Пермский край / Мойте	BD Biosciences	554723
CD14-PE	eBioscience	12-0149-41
CD4-PacBlue	BD Pharmingen	68436
Lineage коктейль 1 (лин 1)-FITC	BD Biosciences	340546
CD11c-PE	BD Biosciences	347637
CD123-PE	BD Biosciences	340545
Кролик против NF-kB (p65)	Сантакрус	SC-372
Alexa647 F (аb ') 2 козы против IgG кролика	Invitrogen	A21246
DAPI	Invitrogen	D21490
ImageStream X	Amnis

Сотовые типа	FITC	PE	Alexa 647	PacBlue
Моноцитарный		CD14	NF-kB (p65)
MDC	Lin1	CD11c	NF-kB (p65)	CD4
PDC	Lin1	CD123	NF-kB (p65)	CD4