Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Эндотелиальных клеток со-культуры посредником Созревание эмбриональных стволовых клеток человека в поджелудочной железы инсулин продуцирующих клеток в направленной дифференцировки подход

15.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/3759

⸱

27 марта 2012 г.

 , 
1Department of Bioengineering, University of Pittsburgh, 2Department of Chemical Engineering, University of Pittsburgh

В этой статье

Краткое содержание

Данное исследование описывает направленной дифференцировки подход в стимулировании панкреатической дифференциации эмбриональных стволовых клеток человека. Большое значение имеет вывод, что эндотелиальных клеток со-культуры посредником созревания человеческих эмбриональных стволовых клеток, полученных в поджелудочной предшественников инсулина экспрессирующие клетки.

Аннотация

Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) обладают двумя основными характеристиками: они могут бесконечно размножаться in vitro в недифференцированном состоянии и являются плюрипотентными, обладая тем самым потенциалом к дифференцировке в несколько клеточных линий. Такие свойства делают ЭСК чрезвычайно перспективными для применения в клеточной терапии и регенеративном лечении 1Однако для полной реализации их потенциала клетки должны быть дифференцированы в зрелые и функциональные фенотипы, что представляет собой сложную задачу. Перспективным подходом к индуцированию клеточной дифференцировки является максимально точное воспроизведение пути органогенеза в in vitro Обстановка. Известно, что развитие поджелудочной железы происходит в несколько определенных стадий 2...начиная с энтодермы, из которой могут развиваться несколько органов, включая печень и поджелудочную железу. Индукция энтодермы может быть достигнута путем модуляции сигнального пути nodal посредством добавления Activin A. 3 в сочетании с несколькими факторами роста 4-7Клетки окончательного энтодерма затем подвергаются панкреатической коммитации путем ингибирования сигнального пути sonic hedgehog, что может быть достигнуто in vitro путем добавления циклопамина 8Созревание поджелудочной железы опосредовано несколькими параллельными процессами, включая, помимо прочего, ингибирование Notch-сигналинга, агрегацию предшественников поджелудочной железы в трехмерные кластеры и индукцию васкуляризации. На сегодняшний день наиболее успешным in vitro созревание прогениторных клеток поджелудочной железы, полученных из ЭСК, было достигнуто путем ингибирования Notch-сигналинга с помощью добавления DAPT 9Несмотря на успех, этот метод приводит к низкому выходу зрелого фенотипа с пониженной функциональностью. Менее изученной областью является влияние сигналинга эндотелиальных клеток на созревание поджелудочной железы, которое все чаще рассматривается как важный фактор, способствующий созреванию островков поджелудочной железы in vivo. 10,11.

В данном исследовании изучается влияние сигнальных путей эндотелиальных клеток на созревание прогениторных клеток поджелудочной железы, полученных из эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) человека, в инсулин-продуцирующие островоподобные клетки. Мы описываем многостадийный протокол направленной дифференцировки, при котором ЭСК человека сначала индуцируются в энтодерму с помощью Activin A совместно с ингибированием пути PI3K. Панкреатическая спецификация клеток энтодермы достигается путем ингибирования сигнального пути sonic hedgehog с помощью циклопамина в сочетании с ретиноидной индукцией путем добавления ретиноевой кислоты. Заключительный этап созревания индуцируется за счет сигналинга эндотелиальных клеток, реализованного с помощью конфигурации совместного культивирования. Несмотря на то, что в совместном культивировании были протестированы несколько типов эндотелиальных клеток, в данной работе мы представляем данные с использованием микрососудистых эндотелиальных клеток сердца крысы (RHMVEC), главным образом для упрощения анализа.

Протокол

1. Сотовые обслуживание

  1. H1 чЭСК (WiCell) поддерживали на чЭСК квалифицированных матригелем лунок с mTeSR1 СМИ, со средствами массовой информации меняются каждый день. Лунки покрыты разбавленного раствора матригелем, получают путем добавления 300 мкл чЭСК матригелем в 25 мл DMEM: F12. 1 мл этого раствора матригелем был добавлен в каждую лунку с шестью лунками, или 400 мкл в каждую лунку добавляют по 12-луночного планшета и позволили, чтобы покрыть в течение 1 часа при комнатной температуре. Клетки механически пассировать на раскол соотношении 1:4, очищая колонии, как только они достигнут между 1 и 1,5 мм в диаметре.
  2. RHMVEC (VEC технологий) была сохранена в MCDB-131 средства массовой информации со средствами массовой информации меняются каждый день. Клетки были разделены на трипсинизации раз 80% слиянии было достигнуто на раскол соотношении 1:3. Эндотелиальных клеток между проходы 3 и 7 были использованы для настоящего исследования.

2. Подготовка растворы

  1. Активин была преобразована в 50 мкг / мл в стерильные PBS, содержащего 0,1% бычьего сывороточного альбумина. Решение было аликвоты и хранили при -20 ° C.
  2. ЭФР был преобразован в 500 мкг / мл в стерильные 10 мМ уксусной кислоты. Решение было аликвоты и хранили при -20 ° C.
  3. Инсулин был преобразован в 10 мг / мл, добавив подкисляют H 2 O (рН ≤ 2), подготовленный при добавлении 0,1 мл ледяной уксусной кислоты в 10 мл воды.
  4. DAPT был преобразован в ДМСО при 18 мг / мл. Кроме того, было разбавляют до концентрации 300 мкМ в DMEM: F12, аликвоты и хранили при -20 ° C.
  5. KAAD-Cyclopamine был преобразован в ДМСО при 5mg/ml. Кроме того, было разбавляют до концентрации 2 мкМ в DMEM: F12, аликвоты и хранили при -20 ° C.
  6. All-транс-ретиноевой кислоты была воссоздана на 2,7 мг / мл 95% этанола. Кроме того, было разбавляют до 2 мМ концентрации в DMEM: F12, аликвоты и хранили при -80 ° C.

3. Окончательное энтодермы (DE) и поджелудочной железы предшественников (ПП) Индукционные

  1. После чESC колонии достигнута между 1 и 1,5 мм в диаметре, DE индукция проводилась путем добавления DMEM: F12 дополнены B27, 0,2% BSA, 100 нг / мл Активин и 1 мкМ вортманнин в течение 4 дней (день 0-4-й день), со средствами массовой информации меняются каждый день.
  2. После DE индукции была завершена, индукция поджелудочной предшественников было вызвано изменением СМИ DMEM: F12 дополнены B27, 0,2% BSA и KAAD-Cyclopamine в концентрации 0,2 мкМ в течение 24 часов (день 4-5-й день).
  3. Через 24 часа СМИ было изменено на DMEM: F12 дополнены B27, 0,2% BSA, KAAD-Cyclopamine 0,2 мкм концентрация и полностью транс-ретиноевой кислоты при концентрации 2 мкМ в течение 3 дней со средствами массовой информации меняются каждый день (День 5-8-й день) .

4. Созревание поджелудочной железы

  1. После индукции PP, все группы было изменено на созревание средства массовой информации состоит из DMEM: F12 дополнены B27, 0,2% BSA, 10 мМ никотинамид, 25 мкг / мл инсулина, 30 нМ Na 2 SeO 3 и 50 мкг / мл трансферрина на 2 гн я со средствами массовой информации меняются каждый день (День 8-10 день).
  2. Через 2 дня в созревании СМИ, заключительный этап созревания осуществляется параллельно, используя несколько различных условиях для сравнения. Дифференциация вызывали на следующих условиях: (i) с помощью надреза ингибитор DAPT (II) с использованием со-культуру средств массовой информации только без эндотелиальных клеток, как контроль и (III) с помощью контакта со-культуры RHMVEC клеток. Клетки были сохранены в DAPT или со-культуральной среды в течение недели (10 день-17 день) в средствах массовой информации меняются каждый день.
    1. DAPT средств массовой информации была подготовлена ​​дополняющий созревания СМИ с 30 DAPT мкМ. Клетки этой группы были впервые подвергается завершить MCDB131 в течение 24 часов, а затем подвергается DAPT средств массовой информации в течение 6 дней (день 11 день 17).
    2. Со-культуры средств массовой информации была подготовлена ​​путем дополнения MCDB-131 средств массовой информации с B27, 0,2% BSA, 10 мМ никотинамид, 10 нг / мл ЭФР, 1 мкг / мл гидрокортизона, 10 мг EndoGro, 90 мкг / мл гепарина. Для контроля состояния среды дифференциации клетки подвергались воздействиюв MCDB-131 полной среде в течение 24 часов (день 10-11-й день), после чего средства массовой информации было изменено на совместное питательных сред в течение 6 дней (день 11-День 17) (без эндотелиальных клеток).
    3. Для контакта со-культура состояние, один миллион RHMVEC был добавлен в дифференциации клеток в полной MCDB-131 средства массовой информации (VEC технологий) в течение 24 часов (10 день-11 день), чтобы можно было смонтировать. Через 24 часа СМИ было изменено на совместное питательных сред в течение 6 дней (день 11-День 17) со средствами массовой информации меняются каждый день.

5. QRT-PCR анализа

  1. В конце каждого этапа дифференциации (энтодермы, поджелудочной железы предшественников, зрелый островок) лизировали и РНК извлекали с помощью NucleoSpin РНК II добычи комплект в соответствии с инструкциями производителя.
  2. РНК анализом качества, проверяя РНК поглощению при 260 нм и 280 нм, а затем РНК количественного использования SmartSpec Plus спектрофотометр.
  3. Обратной транскрипции проводили с использованием ImProm II обратной транскрипции кего в соответствии с инструкциями производителя. Все реакции проводились с 100 нг РНК.
  4. QRT-PCR проводили с использованием Mx3005P КПЦР системы (Agilent) и Блестящие II SYBR Green КПЦР мастер смеси в соответствии с инструкциями производителя. Праймеров приведены в таблице 1. Инициализации шаг был выполнен на 50 ° С в течение 2 минут, затем 95 ° С в течение 10 минут. 50 циклов амплификации осуществляется следующим образом: 95 ° C в течение 30 секунд, 54 ° C в течение 30 секунд и 72 ° С в течение 1 минуты.
  5. Повязку меняют целевой экспрессию мРНК на недифференцированные клетки была рассчитана из значений КТ, используя следующие формулы:
    ΔCT (Маркер я) = CT (Маркер я) - КТ (GAPDH)
    Δ ΔCT (Маркер я) = ΔCT (Маркер я) (образец) - ΔCT (Маркер я) (Недифференцированная клетки)
    Относительное выражение (маркер я) = 2-ΔΔCT(Маркер я)

6. Иммуноцитохимическая

  1. В конце каждого этапа дифференциации (энтодермы, поджелудочной железы предшественников, зрелый островок) клетки фиксировали в 4% формальдегида в течение 15 минут при комнатной температуре.
  2. Фиксированные клетки проницаемыми использованием 0,25% Тритон Х-100 (TX) в течение 15 минут.
  3. Неспецифические окрашивания был заблокирован инкубации в 10% осел в сыворотке 0,05% ТХ на 30 минут.
  4. Первичная инкубации антител проводили ночи при 4 ° C в блокирующем буфере в рекомендованных разведение антител (см. таблицу 1).
  5. Клетки промывали 0,05% TX три раза в течение 5 минут.
  6. Вторичный инкубации антител проводили в течение одного часа при комнатной температуре в темноте с соответствующими антителами разводят в блокирующем буфере.
  7. Клетки промывали 0,05% TX три раза в течение 5 минут.
  8. Ядерная окрашивание проводили путем инкубации с Hoescht пятно на разведении 1:1000 в PBSв течение 5 минут, затем 3 промывок PBS.
  9. Фиксированные и окрашенные клетки были обследованы использовании Olympus IX81 инвертированного микроскопа и Метаморф обработки изображений.

7. Представитель Результаты

Добавление Активин и вортманнин в недифференцированное чЭСК в течение 4 дней вызывает окончательное энтодермы, что подтверждается QRT-PCR анализ на маркеры DE Sox17, CXCR4 и Foxa2 и иммунной для Sox17, как показано на рисунке 2. Дифференциация клеток поджелудочной железы к предшественников после добавления cyclopamine и ретиноевая кислота была подтверждена QRT-PCR поджелудочной железы прародитель маркеров и иммуногистохимическое Pdx1, как показано на рисунке 3.

На заключительной стадии дифференциации, свяжитесь со-культуры RHMVEC клетки сильно индуцированного регуляция инсулина выражение в чЭСК полученных клеток поджелудочной железы предшественников. Эффективность совместной культуре опосредованной дифференциации был проанализирован сотрудничестваmparing с контролем состояния с помощью DAPT. DAPT был использован в качестве положительного контроля, поскольку он является одним из наиболее широко используемых методов для достижения поджелудочной созревания. Поскольку со-культуры была проведена в модифицированной среде с добавлением факторов, поддерживающих эндотелиальных клеток, дополнительный контроль осуществляется со средствами массовой информации в отсутствии эндотелиальных клеток проверить влияние средств массовой информации на дифференциацию. Подробности этого анализа представлены на рисунке 4.

figure-protocol-1
Рисунок 1. Многоступенчатая протокол для дифференциации чЭСК в инсулин клеток, экспрессирующих.

figure-protocol-2
Рисунок 2. Окончательное индукции энтодермы из человеческих эмбриональных стволовых клеток. А) QRT-PCR анализ представитель маркеров ДЭ чЭСК клетки подвергаются активин и вортманнин в течение 4 дней. Результаты ар электронной нормированы по отношению к недифференцированной чЭСК. B) Sox17 окрашивания (зеленый) и DAPI (синий), показывают, ядерная выражение Sox17. Шкала бар: 50 мкм.

figure-protocol-3
Рисунок 3. Поджелудочной предшественников индукции эмбриональных стволовых клеток, полученных энтодермы клетками. А) QRT-PCR анализ ранних маркеров поджелудочной железы в чЭСК полученных энтодермы клетки подвергаются cyclopamine и ретиноевой кислоты в течение 4 дней после индукции DE. Результаты нормированный по отношению к недифференцированной чЭСК. B) Pdx1 окрашивания (фиолетовый) и DAPI (синий), показывают, ядерная выражение Pdx1. Шкала бар: 50 мкм.

">

figure-protocol-4
Рисунок 4. Стадия созревания поджелудочной железы) QRT-PCR анализ гормонов поджелудочной железы чЭСК после созревания поджелудочной использованием DAPT, свяжитесь со-культуры или совместное культуры средств массовой информации (контроль). Результаты нормированный по отношению к недифференцированной чЭСК. р значений, полученных студентом т-тест. В) Со-культуры Дил-Ac-ЛПНП помечены RHMVEC (красный), показывают, регионы, где КЭ приложить к пластинке, если есть пустые пространства (сверху), других RHMVEC можно найти в непосредственном контакте с дифференциации ESC (внизу). C) С-пептид (зеленый) для окрашивания клеток дифференцирована использованием со-культуры методом. Шкала бар: 12,5 мкм (вверху) и 50 мкм (нижний) D) окрашивания в RHMVEC демонстрирует не инсулин выражение в RHMVEC.

Маркер Primer1 (5 'к 3') Primer2 (5 'к 3') Ссылка
SOX17 CTCTGCCTCCTCCACGAA CAGAATCCAGACCTGCACAA 12
CXCR4 CACCGCATCTGGAGAACCA GCCCATTTCCTCGGTGTAGTT 4
FOXA2 GGAGCGGTGAAGATGGAA TACGTGTTCATGCCGTTCAT 12
PDX1 AAGTCTACCAAAGCTCACGCG GTAGGCGCCGCCTGC 4
PTF1 CATAGAGAACGAAACCACCCTTTGAG GCACGGAGTTTCCTGGACAGAGTTC 12
HLXB9 CACCGCGGGCATGATC ACTTCCCCAGGAGGTTCGA 4
HNF6 TGTGGAAGTGGCTGCAGGA TGTGAAGACCAACCTGGGCT 5
PAX6 CGAATTCTGCAGGTGTCCAA ACAGACCCCCTCGGACAGTAAT 5
NKX6.1 AGACCCACTTTTTCCGGACA CCAACGAATAGGCCAAACGA 5
ISL1 GATCTATGTCACCTCGCAAGG TACAACCACCATTTCACTG 12
Глюкагон AGGCAGACCCACTCAGTGA AACAATGGCGACCTCTTCTG 4
Инсулина AAGAGGCCATCAAGCAGATCA CAGGAGGCGCATCCACA 12

Таблица 1. Грунтовки для КПЦР реакций.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В поджелудочной развития, дифференциации клеток поджелудочной железы находятся в непосредственной близости с эндотелиальных клеток от аорты, кроме того, панкреатических островков густо васкуляризированной для содействия быстрому обмену глюкозы в крови и островок гормонов. Учитывая эти факты, это не удивительно, что эндотелиальные клетки играют важную роль в процессе органогенеза поджелудочной железы. В то время как значение эндотелиальных клеток поджелудочной железы при развитии все более и более высокую оценку, ее роль...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы признаем, поддержка NIH Новый Новатор премии DP2 116520 и ORAU Ральф Поу младший факультета повышения Award.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Название реагента Компания Номер по каталогу Концентрации
mTeSR1 (с дополнением) Технологии стволовых клеток 5850
чЭСК квалифицированных матригелем BD Biosciences 354277
DMEM: F12 Invitrogen 11330-032
MCDB-131 Invitrogen 10372019
MCDB-131 (завершен) VEC технологии MCDB-131
Дополнение B27 Invitrogen 17504044
Активин R & D 338-AC 100ng/ml
Вортманнин Invitrogen W3144 1 мкм
KAAD-Cyclopamie Sigma-Aldrich C4116 0,2 мкм
All-транс-ретиноевой кислоты Sigma-Aldrich R2625 2 мкм
DAPT Sigma-Aldrich D5942 30 мкм
Никотинамид Sigma-Aldrich N0636 10 мМ
Селенит натрия Sigma-Aldrich S5261 30 нМ
Инсулин Sigma-Aldrich I1882 25 мкг / мл
Трансферрина Sigma-Aldrich T8158 50 мкг / мл
ЭФР R & D 236-EG 10ng/ml
EndoGro VEC технологии ENDOGRO 10 мг
Гепарин Sigma-Aldrich H3149 90μg/ml
Гидрокортизон Sigma-Aldrich H0888 1μg/ml
NucleoSpin РНК II Macherey Nagel 740955
ImProm II обратной транскрипции системы Promega A3800
Блестящий II SYBR Green КПЦР мастер смеси Straragene 600548
Sox17 козел поликлональных IgG Санта-Крус SC-17355 1/500
PDX1 коза поликлональных IgG Санта-Крус SC-14662 1/500
С-пептид кролика поликлональных Сотовые сигнализации 4593 1/500
Alexa Fluor 488 осел анти-IgG кролика Invitrogen А-21206 1/1000
Alexa Fluor 647 осел анти-IgG козы Invitrogen А-21447 1/1000

Таблица 2. Реагенты и наборы.

Ссылки

  1. De Vos, J., Assou, S., Tondeur, S., Dijon, M., Hamamah, S. Les cellules souches embryonnaires humaines : de la transgression de l'embryon humain á la médecine régénératrice de demain. Gynécologie Obstétrique & Fertilité. 37, 620-626 (2009).
  2. Murtaugh, L. C., Melton, D. A. Genes, Signals, and Lineages in Pancreas Development. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 19, 71-89 (2003).
  3. Kubo, A., Shinozaki, K., Shannon, J. M., Kouskoff, V., Kennedy, M., Woo, S., Fehling, H. J., Keller, G. Development of definitive endoderm from embryonic stem cells in culture. Development. 131, 1651-1662 (2004).
  4. D'Amour, K. A., Bang, A. G., Eliazer, S., Kelly, O. G., Agulnick, A. D., Smart, N. G., Moorman, M. A., Kroon, E., Carpenter, M. K., Baetge, E. E. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nat. Biotech. 24, 1392-1401 (2006).
  5. Zhang, D., Jiang, W., Liu, M., Sui, X., Yin, X., Chen, S., Shi, Y., Deng, H. Highly efficient differentiation of human ES cells and iPS cells into mature pancreatic insulin-producing cells. Cell Res. 19, 429-438 (2009).
  6. Basma, H., Soto-Gutiérrez, A., Yannam, G. R., Liu, L., Ito, R., Yamamoto, T., Ellis, E., Carson, S. D., Sato, S., Chen, Y., Muirhead, D. Differentiation and Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Hepatocytes. Gastroenterology. 136, 990-999 (2009).
  7. Phillips, B. W., Hentze, H., Rust, W. L., Chen, Q. -P., Chipperfield, H., Tan, E. -K., Abraham, S., Sadasivam, A., Soong, P. L., Wang, S. T., Lim, R., Sun, W., Colman, A., Dunn, N. R. Directed Differentiation of Human Embryonic Stem Cells into the Pancreatic Endocrine Lineage. Stem Cells and Development. 16, 561-578 (2007).
  8. Kim, S. K., Melton, D. A. Pancreas development is promoted by cyclopamine, a Hedgehog signaling inhibitor. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95, 13036-13041 (1998).
  9. Docherty, K. Growth and development of the islets of Langerhans: implications for the treatment of diabetes mellitus. Current Opinion in Pharmacology. 1, 641-649 (2001).
  10. Nikolova, G., Jabs, N., Konstantinova, I., Domogatskaya, A., Tryggvason, K., Sorokin, L., Fässler, R., Gu, G., Gerber, H. -P., Ferrara, N., Melton, D. A. The Vascular Basement Membrane: A Niche for Insulin Gene Expression and [beta]> Cell Proliferation. Developmental Cell. 10, 397-405 (2006).
  11. Yoshitomi, H., Zaret, K. S. Endothelial cell interactions initiate dorsal pancreas development by selectively inducing the transcription factor Ptf1a. Development. 131, 807-817 (2004).
  12. Osafune, K., Caron, L., Borowiak, M., Martinez, R. J., Fitz-Gerald, C. S., Sato, Y., Cowan, C. A., Chien, K. R., Melton, D. A. Marked differences in differentiation propensity among human embryonic stem cell lines. Nat. Biotech. 26, 313-315 (2008).
  13. Banerjee, I., Sharma, N., Yarmush, M. Impact of co-culture on pancreatic differentiation of embryonic stem cells. J. Tissue Eng. Regen. Med. 5, 313-323 (2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Эмбриональные стволовые клетки человекаиндукция дефинитивного энтодермального слояиндукция предшественников поджелудочной железыэндотелиальная клеточная сигнализацияиммунофлуоресцентная микроскопияанализ методом количественной ПЦРмикрососудистые эндотелиальные клетки сердца крысы
Эндотелиальных клеток со-культуры посредником Созревание эмбриональных стволовых клеток человека в поджелудочной железы инсулин продуцирующих клеток в направленной дифференцировки подход
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.