TransFLP - метод генетической модификации<em&gt; Холерный вибрион</em&gt; На основе природных преобразований и FLP-рекомбинации

Краткое содержание

Быстрый способ изменить геном V. вибрион Описано. Эти модификации включают в себя удаление отдельных генов, генных кластеров и геномные острова, а также интеграции коротких последовательностей (например, промоутер элементов или сродство-теги последовательности). Метод основан на естественной трансформации и FLP-рекомбинации.

Аннотация

Для манипуляций с бактериальными хромосомами доступно несколько методов^1-3. Большинство этих протоколов основаны на вставке условно реплицирующихся плазмид (например, содержащих pir-зависимые или термочувствительные репликоны^1,2). Эти плазмиды интегрируются в бактериальные хромосомы посредством гомологичной рекомбинации. Такие инсерционные мутанты часто используются непосредственно в экспериментах. В качестве альтернативы может быть проведен отбор на эксцизию плазмиды с ее последующей потерей, что для грамотрицательных бактерий часто основано на использовании контрселективного фермента леван-сукразы, кодируемого геном sacB⁴. Эксцизия может либо восстановить генотип, существовавший до вставки, либо привести к обмену между хромосомой и плазмидной копией модифицированного гена. Недостатком этой методики является ее трудоемкость и длительность. Сначала необходимо клонировать плазмиду; затем требуется ее горизонтальный перенос в V. cholerae (преимущественно путем конъюгации с донорным штаммом E. coli) или искусственная трансформация последнего; кроме того, эксцизия плазмиды происходит случайным образом и может либо восстановить исходный генотип, либо создать желаемую модификацию при отсутствии положительного отбора. Здесь мы представляем метод быстрого манипулирования хромосомой(ми) V. cholerae⁵ (Рисунок 1). Данный метод TransFLP основан на недавно обнаруженной хитин-опосредованной индукции естественной компетентности этого организма⁶ и других представителей рода Vibrio, таких как V. fischeri⁷. Естественная компетентность позволяет поглощать свободную ДНК, включая фрагменты ДНК, полученные с помощью ПЦР. После поглощения ДНК рекомбинирует с хромосомой при наличии фланкирующих гомологичных областей длиной не менее 250-500 bp⁸. Включение селективного маркера между этими фланкирующими областями позволяет легко обнаруживать часто возникающие трансформанты.

Этот метод может быть использован для различных генетических манипуляций с V. cholerae и, потенциально, с другими природно компетентными бактериями. В дополнение к нашему ранее опубликованному исследованию по делеции одиночных генов и добавлению последовательностей аффинных меток⁵, мы приводим три новых примера того, чего можно достичь с помощью данного метода. В настоящий протокол TransFLP включены несколько этапов оптимизации исходного протокола природной трансформации, индуцированной хитином⁶. Среди них, в частности, замена фрагментов панциря краба коммерчески доступными хлопьями хитина⁸, использование ПЦР-продуктов в качестве трансформирующего материала⁹ и добавление сайтов-мишеней для FLP-рекомбинации (FRT)⁵. Сайты FRT позволяют осуществлять сайт-специфическое вырезание селективного маркера при помощи Flp-рекомбиназы¹⁰.

Протокол

Метод TransFLP (рис. 1) на примере трех различных подходов: I) удаление двух соседних генов, кодирующих вирулентности детерминанты В. вибрион (например, ΔctxAB); II) удаление островка патогенности (например, ΔVPI-1) и III) интеграция полимеразы T7-зависимой РНК-последовательность промотора перед геном из интереса, который впоследствии позволяет его искусственное выражение в соответствующем фоне деформации (например, T7-tfoX) (рис. 2).

1. Получение хитина хлопья

1. Вес 50-80 мг хитина хлопья в стандартных 1,5 мл пластиковую трубку. Это могут быть получены в большом объеме. Хитин хлопья являются коммерчески доступными от Sigma (кат. номер C9213).
2. Автоклав хлопья поддержанию крышки трубы открыты.
3. Немедленно закройте крышками после автоклав остынет.
4. Магазин автоклавного хитина хлопьевпри комнатной температуре.

2. Дополнительно: Искусственная трансформация V. вибрион с Flp рекомбиназой кодирования плазмиды

1. Подготовка электрокомпетентные V. вибрион клеток с использованием стандартных методов ^11. Хранить аликвоты компетентных клеток при -80 ° C.
2. Добавить 1-2 мкл регулярные мини-подготовка плазмиды PBR-ФЛП ⁵ до электрокомпетентные V. вибрион клеток и передачи смеси в кювете электропорации (0,2 см ширины щели).
3. Применить импульса на уровне 1,6 кВ.
4. Добавить 0,9 мл SOC среде, мягко передавать ячейки в стандартном 14 мл трубки. Инкубируйте неподвижные в течение 2,5 до 3 часов при 30 ° C.
5. Плита 100 мкл и 300 мкл на пластинах LB, содержащей 100 мкг / мл ампициллина и инкубировать при 30 ° C в течение ночи.
6. Очищают одного клона и магазин как глицерин наличии для будущих экспериментов TransFLP.

3. Олигонуклеотидов Дизайн и полимеразной цепной реакции

1. По меньшей мере шесть олигонуклеотидов, необходимых для усиления участка ДНК (ы) интерес, а также FRT-окружении антибиотиков кассеты методом ПЦР (рис. 3). Рекомендуется также включать в себя пару грунтовки олигонуклеотидов за пределами вставленного фрагмента ПЦР. Это позволяет проверки интеграции и правильное удаление FRT-окружении антибиотиков кассеты сопротивления (например, изображается как "CHK-вверх" и праймеры "CHK-вниз" на рисунках 3 до 5).
2. Дизайн олигонуклеотидов, № 2, № 3, № 4 и № 5 с осторожностью. Они должны быть в состоянии в достаточной степени отжига (например, ~ 28 б.п.), в шаблоне ДНК. Шаблона ДНК геномной ДНК (гДНК) для праймеров № 2 и № 5 и FRT-Кан-FRT-содержащие ДНК плазмиды, такие как pROD17 ¹² и СКД-FRT-KAN-FRT (это исследование) для праймеров № 3 и № 4 ( рис. 3а).
3. Дизайн праймеров № 2 к № 5 позволяет обширная база спаривания на их 5'-конце между # 2 / # 3 и # 4 / # 5, соответственно (рис. 3А вставка). Два раунда ПЦР следовать.
4. Выполните три независимые реакции ПЦР, как ^1-й раунд ПЦР. Первый из них будет усиливать вверх по течению области гена / ДНК регионе интересов, с помощью олигонуклеотидов № 1 и № 2. ПЦР должно привести фрагмент, по меньшей мере, 500 б.п. в длину, чтобы гомологичной рекомбинации в клетках. Более короткие фрагменты (~ 250 б.п.) может быть достаточным ^8, но не рекомендуется.
5. Параллельно выполнить второй ПЦР, который усиливает FRT-окружении антибиотиков кассеты. Для примеров, приведенных здесь, мы в основном использовали APH (кан ^R). Использование олигонуклеотидов № 3 и № 4 для этой реакции (рис. 3А).
6. Одновременно усиливаются вниз по течению области ДНК с помощью ПЦР (третьего образца). ПЦР-фрагмента должна быть не менее 500 б.п. в длину. Выполните ПЦР с гДНК в качестве матрицы и олигонуклеотидов № 5 и № 6 (рис. 3А).
7. После очистки всех трех PCRфрагментов, выполните ^2-й раунд ПЦР. Используйте равные смесь всех трех фрагментов, полученных в первом туре в качестве шаблона. Усиление катализируется олигонуклеотидов № 1 и № 6. Полученные ПЦР-фрагмента (рис. 3В) служит преобразование ДНК в естественный эксперимент преобразование (рис. 1).

4. Хитин-индуцированной естественное преобразование

1. Расти V. вибрион клетки аэробно в богатой среде при температуре 30 ° C до достижения оптической плотности при 600 нм примерно 0,5.
2. Урожай бактерий с помощью центрифугирования. Вымойте гранул один раз в определенный искусственной среде (DASW ⁶⁾ до ресуспендирования клеток в 2 объемов DASW. Добавить 1 мл культуры до 50-80 мг стерильной хитина хлопья (объяснено в пункте 1). Если бактерии гавани плазмиды PBR-ФЛП (дополнительный пункт 2), добавить ампициллин (50 мкг / мл) в культуру. Инкубировать при 30 ° С в течение 16-24 часов без движения.
3. Добавить & Gе, 200 нг ^2-й круглый ПЦР-фрагмента производных (объясняется в пункте 3). Тщательно перемешать без широкой отсоединения от бактерий хитин поверхности. Инкубировать при температуре 30 ° C в течение 24 часов без движения.
4. Vortex культуры широко течение ≥ 30 сек. Распространение 100-300 мкл на селективной среде LB пластины (например, канамицин и гентамицин содержащих LB пластины для примеров, приведенных здесь). Используйте двойные селективные пластины, если бактерии питать плазмиды PBR-ФЛП, добавив ампициллина одновременно с другими антибиотиками. Инкубируйте пластины при температуре 30 ° C в течение 16-24 ч или до колонии видны.
5. Изолировать одного трансформантов с селективным пластин. Такие трансформантов заменили оригинальные хромосомный локус по ПЦР-фрагмента в связи с двойным событием кроссовера. Эти штаммы могут быть непосредственно использованы для дальнейших экспериментов в случае удаления антибиотика кассеты не надо.

5. Удаление Селективный кассеты (ы) FlpРекомбинации

1. Искусственно превратить ваш трансформантов плазмидной PBR-ФЛП, как описано в пункте 2, если не сделано до того, как природные анализ трансформации.
2. Рост бактерий на LB агаром, содержащей ампициллин при 37 ° C в течение 16-24 часов. Функции: изменение температуры между течение 2-3 ч до 40 ° C как выражение ФЛП из плазмиды PBR-ФЛП-де-репрессированы при более высоких температурах ^5,10; передача бактерий на свежую пластин прим. 8 ч инкубации.
3. Тест на чувствительность антибиотиков (продемонстрировано здесь для канамицин, рисунок 1), restreaking клонов параллельно содержащий антибиотик и антибиотиков агаром. Изолировать один чувствительный колонии. Замораживание устойчивых к ампициллину клон как глицерин складе, если вы намерены и в дальнейшем изменять напряжение с другими удаления / вставки использованием TransFLP.

6. Плазмида отверждения

1. Расти культуры ночи в аэробных условиях ипри 30 ° C. Использование обогащенной среде без добавления любого антибиотика.
2. Дополнительно: Вырастить свежие культуре в течение 3-6 часов путем разбавления ночь 1:100 культуры в свежую без антибиотиков среды.
3. Плиты или полосы разбавления (ы) культуры на равнине пластины агара LB (ы) и инкубировать при 30 ° С в течение 8-16 ч (до колонии видны).
4. Тест на ампициллин-чувствительность клонов restreaking клонов параллельно содержащий антибиотик и антибиотиков агара (рис. 1). Замораживание ампициллин-чувствительного штамма как глицерин акций.

Результаты

Представитель результаты трех примерах показаны на рисунках 4 до 6. Первый подход, направленный на удаление соседних генов ctxA и ctxB. Вместе они кодируют основной фактор вирулентности V. вибрион, холерный токсин. Мы разработали олигонуклеотидов для метода TransFLP, как описано выше, и в соответствии с рисунком 3. Родительского штамма, промежуточные деформации несущих FRT-окружении антибиотиков кассеты сопротивление на оригинальные локус ДНК ...

Обсуждение

Метод TransFLP описано выше, и в других местах ⁵ была широко используется в нашей лаборатории. Такого рода генетических манипуляций, которые возможно включать, среди прочего: удаление отдельных генов и генных кластеров, удаление геномной островах (например, VPI-1), вставки последовательностей перед интерес гена (например, промоутер последовательности) и вставки последовательностей в конце конкретного гена (например, теги кодирования сродство).

Импорт пре...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии
Хитин хлопьев	Сигма	C9213	Автоклавирования требуется
ДОПОЛНИТЕЛЬНО: Micropulser (в случае антибиотиков кассеты должны быть изъяты по Flp рекомбиназой закодированы на PBR-ФЛП)	Biorad	165-2100	Или сопоставимо electroporators