Методическая статья

GC на основе обнаружения Aldononitrile ацетат производные кислоты и глюкозамина мурамовой для определения микробной остатков в почве

17K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/3767

⸱

19 мая 2012 г.

 ,  , 
1DOE-Great Lakes Bioenergy Research Center, University of Wisconsin, Madison, 2Department of Soil Science, University of Wisconsin, Madison, 3Department of Soil and Water Science, University of Florida

В этой статье

Краткое содержание

Мы описываем метод протокола для GC на основе анализа aldonitrile ацетат производных глюкозамина и мурамовой кислота извлекается из почвы. Для выяснения химического механизма, мы также представляем стратегию, чтобы подтвердить структуру производной и ионов фрагментов, образующихся при ионизации электрона.

Аннотация

Количественный подход к описанию микроорганизмов имеют решающее значение для более глубокого понимания микробной статус и функции в экосистемах. Современные стратегии для микробной анализа включают в себя как традиционные лаборатории культуры зависит от техники и те, которые основаны на прямых добычи и определение определенных биомаркеров 1, 2. Немногие среди разнообразия микробных видов, обитающих в почве может быть культурным, так культура зависит от метода внедрения значительных смещений, ограничение отсутствует в биомаркеров анализа.

Глюкозамин, mannosamine, галактозамина и мурамовой кислоты, хорошо служили в качестве меры живых и мертвых масса микробов, из них глюкозамин (наиболее распространенный) и мурамовой кислоты (единственным из бактериальной клетки) являются наиболее важными составляющими в почве системы 3 , 4. Тем не менее, отсутствие знаний по анализу ограничивает широкой популяризации среди научных коллег. Среди всех Exiжалить аналитических методов, производных для aldononitrile ацетаты затем GC-анализа стала хорошим выбором в отношении оптимального баланса точность, чувствительность, простоту, хороший хроматографического разделения и стабильности на хранение образец 5.

Здесь мы представляем подробный протокол для надежной и сравнительно простой анализ глюкозамин и мурамовой кислоту из почвы после их преобразования в aldononitrile ацетаты. Протокол в основном состоит из четырех этапов: кислотного разложения, образец очистки, производных и GC определения. Шаг за шагом процедуры изменение в соответствии с бывшими публикаций 6, 7. Кроме того, мы представляем стратегию структурной проверки молекулярного иона производная и ее фрагментов ион образуется при ионизации электрона. Мы обратились GC-EI-MS-SIM, LC-ESI-TOF-MS и изотопно-меченых реагентов для определения молекулярной массы aldononitrile ацетат производные глюкозамина и мурАМИК кислоты, мы использовали массовый переход изотопно-меченых производных в ионных спектра для исследования ионных фрагментов каждого производные 8. В дополнение к теоретическому выяснению, проверка молекулярного иона производного и его фрагменты иона будет полезной для исследователей, использующих δ 13 С или ионно фрагменты этих биомаркеров в биогеохимических исследований 9, 10.

Протокол

1. Подготовка проб и извлечения кислоты

  1. Freeze-сухих образцов почвы после коллекцию полей.
  2. Измельчить и гомогенизации проб почвы помощью шаровой мельницы, дробилки почвы, или ступки и пестика.
  3. Взвешивание образцов почвы (содержащие> 0,3 мг N) в 25 мл колбу гидролиза.
  4. Добавить 10 мл 6М HCl в каждую колбу гидролиза, заполните N 2 газа в колбах, а крышка плотно.
  5. Гидролизу при 105 ° C в инкубаторе в течение 8 часов с использованием переключателя автоматического таймера.

2. Пример очистки

  1. Удалить колбы из инкубатора, охладить до комнатной температуры.
  2. Добавить 100 мкл внутреннего стандарта мио-инозит (1 мг мл -1 в воде) в каждую колбу, микс закрученной.
  3. Установить пластиковые воронки слива в 200 мл грушевидной формы колбы с ST / NS 24/40 суставов, устанавливается на пластиковые стаканчики для стабильности.
  4. Fold Ватман № 2 Качественные кругов (11 см в диаметре) в помещениях и набор в воронки.
  5. Swirl каждый гидролиза колбу, и залить раствор в воронку фильтра (можно дальше промывать каждую колбу с ~ 3 мл воды).
  6. Высушите фильтрата с помощью роторного испарителя при температуре ~ 45 ° C, применяя вакуум.
  7. Ресуспендируют сухой остаток от каждой груши колбу с 3 ~ 5 мл воды (использовать ультразвуковую ванну по желанию), и залить в трубу 40 мл тефлон, промыть колбу со второй аликвоты воды.
  8. Скорректировать значение рН до 6,6 - 6,8 использованием 1М КОН решение осадок ионов металлов и других органических молекул.
  9. Удаление осадка путем центрифугирования при 2000 RCF в течение 10 минут.
  10. Вылить надосадочную в 40 мл стеклянная трубка, покрытия труб с открытием парафильмом, замораживание при температуре -20 ° C, то тыкать отверстий в парафильмом.
  11. Морозильнике замороженный супернатант, чтобы удалить всю жидкость.
  12. Растворить остаток с 3 мл сухого метанола, встряхивая тщательно (используется ультразвуковой ванне при желании); крышка трубки, а затем центрифуги в 2000 RCF в течение 10 минут, чтобы решитьиз соли.
  13. Перенести супернатант в 3 мл флакон конической реакции, выпаривают досуха на RapidVap машине при 45 ° C (или под струю сухого азота при желании).
  14. В каждый флакон, добавить 100 мкл восстановления стандартных N-метилглюкамин (1 мг мл -1 в воде) и 1 мл H 2 O, охватывают флакон рот парафильмом, замораживание при температуре -20 ° C, перфорировать парафильмом, а затем заморозить сухой .
  15. Сделать стандартов: добавить 100 мкл мурамовой кислоты (0,5 мг мл -1 в метанол), 100 мкл глюкозамин (1 мг мл -1 в воде), 100 мкл мио-инозит (1 мг мл -1 в воде), 100 мкл N- метилглюкамин (1 мг мл -1 в воде), и 1 мл H 2 O, парафильмом каждого флакона, замораживание при температуре -20 ° C, перфорировать парафильмом, то в морозильнике.

3. Дериватизации

  1. Подготовить производных реагентов содержащих 32 мг мл -1 гидроксиламин гидрохлорида и 40 мг мл -1 4-диметиламино-руridine в пиридин-метанол (4:1 об / об).
  2. Добавить 300 мкл производных реагентов для каждого из reactivials, крышка плотно, и вихрь полностью.
  3. Положите флаконов в 75-80 ° С на водяной бане 35 минут (хорошо запечатаны флаконы, чтобы избежать попадания воды позволяет войти в ампулах).
  4. Удалить из флаконов на водяной бане, охладить до комнатной температуры.
  5. Добавить 1 мл ангидрида уксусной кислоты в каждом из 3 мл reactivials, крышка плотно, и вихрь полностью, то разогревать в 75-80 ° С на водяной бане 25 минут.
  6. Удалить из флаконов на водяной бане, охладить до комнатной температуры.

4. Разделение и измерение

  1. Добавить 1,5 мл дихлорметана в каждом флаконе, крышка плотно, и вихрь полностью.
  2. Добавить 1 мл 1М HCl в каждом флаконе, крышка плотно и вихре тщательно, чтобы решения, чтобы сидеть спокойно, пока два отдельных фраз, аспирации и отказаться от верхней (водной) фазы с помощью пипетки 1000 мкл.
  3. В том же Fashion, извлечения органической фазы в 3 раза, а с 1 мл H 2 O (с последней промывки, проявлять особую осторожность, чтобы все водные верхней фазе была удалена).
  4. Высушите окончательного решения с использованием RapidVap при 45 ° C (или сухой использования азота при желании).
  5. Растворите в 300 мкл этилацетата и гексана (1:1 об / об) и трансфер в 2 мл янтаря завинчивающейся крышкой флакона с небольшим объемом вставки и крышку.
  6. Для количественного анализа методом ГХ-ПИД использовании плавленого кварца неполярной капиллярной колонкой 30 м в длину, 0,25 мм ID, 0,25 мкм толщина пленки; стационарной фазы 5% фенил-, 95% метил-полисилоксан (DB-5 или эквивалент) с водородом или гелия в качестве газа-носителя, в 0,5 мл мин -1 постоянным потоком. Хроматографии лучше на премию "инертный" фазы и водорода перевозчика, но приемлемо на наиболее распространенные сорта и с гелием. Детектор настройки 300 ° C, 400 мл мин -1 воздуха и 30 мл мин -1 для азота игазы водород макияж. Впрыска и печь параметры следующим образом: 1 мкл инъекции раскола (30:1) с GC входе установлен в 250 ° C, начальная температура духовки 120 ° С; держать 1 мин, повысить температуру в духовке при температуре 10 ° C мин. -1 до 250 ° C, удерживайте 2,5 мин;. рампы до 270 ° C при 20 ° С мин -1; провести 2 минуты, рампы до 290 ° C при 20 ° С мин -1, держать 5 минут. Отрегулируйте поток газа-носителя, скорость, так что инозит, глюкозамин и производные мурамовой кислоты элюируются при 250 ° С, а N-метилглюкамин элюируется при 270 ° C.

5. Производные проверка

  1. Используйте мягкую ионизацию LC-ESI-TOF-MS для идентификации молекулярных ионов и определения молекулярного веса производной.
  2. Используйте GC-EI-MS-SIM или GC-EI-MSMS для повышения чувствительности к расследованию целевых ионов производных.
  3. Использование нескольких изотопно меченых реагентов для подготовки производных, а затем использовать массовый переходтех, изотопно меченых производных в MS исследовать молекулярный ион и ион фрагментов.

6. Представитель Результаты

Протокол метода состоит в основном из четырех этапов: кислотного разложения, примеры очищения, производных и GC определения (рис. 1). Пример анализа глюкозамин и мурамовой кислоты из стандартной акции и из образца почвы показано на рисунке 2. Кроме того глюкозамин и мурамовой кислоты, mannosamine и галактозамина (два изомера глюкозамин) также могут быть определены одновременно, используя этот метод. На основе ответов факторов стандартов по отношению к внутреннему стандарту мио-инозит, мы можем количественно этих биомаркеров в образцах почвы. Восстановление стандартной была использована для качественно контролировать процесс производных. Схемы формирования aldononitrile ацетат производные кислоты и глюкозамина мурамовой показано на рисунке 3 .

Предлагаемая структура производных определяется GC-EIMS-SIM для повышения чувствительности, или мягкой ионизации LC-ESI-TOF-MS 8, предлагаемая структура ионных осколков, образующихся при ионизации электронным изучали путем сравнения ионных спектров образцов, полученных с различных инкорпорации изотопов 11. Рисунок 4 показывает массовый переход доминирующей ион м / з 187 aldononitrile ацетат производные глюкозамина в трех сценариях, подготовленных с не-меченых агентов, D-уксусный ангидрит, и U-13 C-глюкозамин. Другие подробную информацию и разъяснения можно отнести к нашей недавней публикации 8, 11. Эта стратегия могла бы служить моделью для изучения химии производных.

figure-protocol-1
Рисунок 1. Измерение схема протокола для анализа глюкозамин и мурамовой кислоты в почвеобразцов. Протокол основном состоит из 4 шагов: Acid пищеварения, очистки, дериватизации и GC определения.

figure-protocol-2
Рисунок 2. GC-FID хроматограммы aldononitrile ацетатов инозит, глюкозамин, мурамовой кислоты, mannosamine, галактозамина и метилглюкамин стандартов и почвы.

figure-protocol-3
Рисунок 3. Схемы формирования aldononitrile ацетат производные кислоты и глюкозамина мурамовой. № 1 представляет нитрил реакции. № 2 представляет ацетилирования.

figure-protocol-4
Рисунок 4. Масс-спектры aldononitrile ацетат производные глюкозамина связанные с доминирующим структурно ионх годов в режиме Е.И. подготовлен с (А) без меток агентов, (B) D-уксусной ангидрит, (C) U-13 C-глюкозамин. Звезда представляет тяжелого изотопа атома изотопа или группы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Представленные GC-метод, основанный на анализе aldononitrile ацетат производные кислоты и глюкозамина мурамовой обеспечивает относительно быстрый метод количественной оценки этих аминосахаров, извлеченных из почвы. Производных химически стабильны, и могут быть определены в одном анализе. Этот метод не только для образцов почвы и может быть упрощена для образцов без почвы матрицы.

Вакуумный насос, используемые в этом методе построена, чтобы быть устойчивыми к кислоте. Кроме того, мы предлагае...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами Министерства энергетики Великих озер биоэнергетики научно-исследовательский центр (DOE BER офис науки DE-FC02-07ER64494). Мы благодарны доктору Сюйдун Чжан и его членов группы за полезные обсуждения технических вопросов и бесценные комментарии по доработке протокола.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Название реагента Компания Номер по каталогу
Мурамовая кислота Sigma-Aldrich M2503-25 мг
D-(+)-глюкозамин гидрохлорид Sigma-Aldrich G1514-100G
N-метил-D-глюкамин Sigma-Aldrich M2004-500G
Мио-инозитол Fisher Scientific A307003G025
Метанол (сухой) Acros органических AC326950010
4-диметиламино-пиридина Acros органических AC148270050
Этилацетат VWR International BJGC100-4
Hydroxlamine гидрохлорид Fisher Scientific H330-100
Пиридин Fisher Scientific P368-500
Ангидрида уксусной кислоты Fisher Scientific A10-100
Дихлорметан (метиленхлорид) Fisher Scientific D37-500
Гексан Fisher Scientific H303-4
Соляная кислота (6M) Fisher Scientific S456-4
Гидроксиламин гидрохлорид -15 N Иконка услуги IN5280
Ангидрида уксусной кислоты -2 H (D 6 C 4 O 3) Acros органических AC174670050
D-глюкоза-U-13 C Кембридж изотопа лаборатории CLM-1396-1
Аммоний sufate -15 N Кембридж изотопа лаборатории NLM-713-1
Наименование оборудования Компания Тип
Rapid-Vap Labconco 790002
Vacum насоса KNF Neuberger D-79112
Гидролиз колбу Fisher Scientific 06 423A
Дериватизации microvial Fisher Scientific 06-100E
GC Hewlett-Packard 6890
MS Hewlett-Packard 5972
LC-ESI-TOF-MS Agilent Agilent серии 1200 ВЭЖХ системы, связанной с Agilent LC / MSD-TOF

Ссылки

  1. Zelles, L. Fatty acid patterns of phospholipids and lipopolysaccharides in the characterisation of microbial communities in soil: a review. Biology and Fertility of Soils. 29, 111-129 (1999).
  2. Kirk, J. L. Methods of studying soil microbial diversity. Journal of Microbiological Methods. 58, 169-188 (2004).
  3. Joergensen, R. G., Emmerling, C. Methods for evaluating human impact on soil microorganisms based on their activity, biomass, and diversity in agricultural soils. Journal of Plant Nutrition and Soil Science. 169, 295-309 (2006).
  4. Guggenberger, G., Frey, S. D., Six, J., Paustian, K., Elliott, E. T. Bacterial and fungal cell-wall residues in conventional and no-tillage agroecosystems. Soil Science Society of America Journal. 63, 1188-1198 (1999).
  5. Amelung, W. Assessment Methods for Soil Carbon. Lal, R., Kimble, J. M., Follett, R. F., Stewart, B. A. , CRC/Lewis Publishers. Boca Raton, FL. 233-270 (2001).
  6. Guerrant, G. O., Moss, C. W. Determination of monosaccharides as aldononitrile, O-methyloxime, alditol, and cyclitol acetate derivatives by gas-chromatography. Analytical Chemistry. 56, 633-638 (1984).
  7. Zhang, X., Amelung, W. Gas chromatographic determination of muramic acid, glucosamine, mannosamine, and galactosamine in soils. Soil Biology and Biochemistry. 28, 1201-1206 (1996).
  8. Liang, C. Investigation of the molecular ion structure for aldononitrile acetate derivatized muramic acid. Journal of Microbiological Methods. 86, 224-230 (2011).
  9. He, H., Xie, H., Zhang, X. A novel GC/MS technique to assess 15N and 13C incorporation into soil amino sugars. Soil Biology and Biochemistry. 38, 1083-1091 (2006).
  10. Glaser, B., Gross, S. Compound-specific delta 13C analysis of individual amino sugars - a tool to quantify timing and amount of soil microbial residue stabilization. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 19, 1409-1416 (2005).
  11. Liang, C., Balser, T. C. Mass spectrometric characterization of amino sugar aldononitrile acetate derivatives used for isotope enrichment assessment of microbial residues. Soil Biology and Biochemistry. 42, 904-909 (2010).
  12. Liang, C., Pedersen, J. A., Balser, T. C. Aminoglycoside antibiotics may interfere with microbial amino sugar analysis. Journal of Chromatography A. 1216, 5296-5301 (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи