$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Микрофлюидные устройства, изготовленные с помощью микролитографии, обеспечивают доступную микросреду для исследований in vivo на малых организмах. Для создания микрофлюидных устройств доступны простые процессы изготовления с использованием методов мягкой литографии 1-3. Микрофлюидные устройства применялись для субклеточной визуализации 4,5, лазерной микрохирургии in vivo 2,6 и визуализации клеток 4,7. Визуализация in vivo требует иммобилизации организмов. Это достигалось с помощью вакуумного всасывания 5,8, конических каналов 6,7,9, деформируемых мембран 2-4,10, всасывания с дополнительным охлаждением 5, анестезирующего газа 11, термочувствительных гелей 12, цианоакрилатного клея 13 и таких анестетиков, как левамизол 14,15. Часто используемые анестетики влияют на синаптическую передачу 16,17 и, как известно, оказывают пагубное воздействие на субклеточный нейронный транспорт 4. В данном исследовании мы демонстрируем устройство на основе мембраны из полидиметилсилоксана (PDMS), которое позволяет проводить иммобилизацию без применения анестетиков для целых генетических модельных организмов, таких как Caenorhabditis elegans (C. elegans), личинки Drosophila и личинки данио-рерио. Эти модельные организмы подходят для исследований in vivo в микрофлюидных устройствах благодаря их малым размерам и оптически прозрачным или полупрозрачным телам. Диаметр тела варьирует от ~10 μm до ~800 μm для ранних личиночных стадий C. elegans и личинок данио-рерио, что требует использования микрофлюидных устройств разных размеров для достижения полной иммобилизации при проведении таймлапс-визуализации высокого разрешения. Эти организмы иммобилизуются с помощью давления, создаваемого сжатым азотом через жидкостный столб, и визуализируются с помощью инвертированного микроскопа. Животные, выпущенные из ловушки, возвращаются к нормальному передвижению в течение 10 min.
Мы демонстрируем четыре применения таймлапс-визуализации на C. elegans, а именно: визуализацию транспорта митохондрий в нейронах, транспорт пресинаптических везикул у мутанта с дефектом транспорта, транспорт глутаматных рецепторов и деление нейробластов Q. Данные, полученные с помощью таких видеозаписей, показывают, что микрофлюидная иммобилизация является полезным и точным способом получения данных in vivo о клеточных и субклеточных событиях по сравнению с использованием анестезированных животных (Figure 1J и 3C-F 4).
Размеры устройства были изменены для обеспечения возможности таймлапс-визуализации различных стадий развития C. elegans, личинок Drosophila первого возраста и личинок данио-рерио. Транспорт везикул, помеченных синаптотагмином с GFP-тегом (syt.eGFP), в сенсорных нейронах демонстрирует направленное движение маркеров синаптических везикул, экспрессируемых в холинергических сенсорных нейронах интактных личинок Drosophila первого возраста. Аналогичное устройство использовалось для проведения таймлапс-визуализации сердцебиения у личинок данио-рерио примерно через 30 часов после оплодотворения (hpf). Эти данные показывают, что разработанные нами простые устройства могут быть применены к различным модельным системам для изучения ряда цитобиологических и developmental-феноменов in vivo.