Качество эмбриональных фибробластов мыши (MEFs) определяется по праву мышах, таких как CF-1. Плюрипотентности, поддерживающих MEFs и условных СМИ (CM), полученные из этих должен содержать оптимальные концентрации Активин, Gremlin и Tgfβ1, необходимых для Активин / Узловые и FGF пути к совместной оперативно поддерживать самообновления и плюрипотентности.
Методическая статья
Подготовка мышиных эмбриональных фибробластов подходит для культивирования эмбриональных и индуцированных плюрипотентных стволовых клетках
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
В целом, эмбриональные стволовые клетки человека (hESCs) и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека (hiPSCs)1 могут культивироваться при различных условиях. Однако создать эффективную систему для культивирования этих клеток довольно сложно. Поскольку условия культивирования могут влиять на экспрессию генов, обеспечивающих плюрипотентность hESCs и hiPSCs, оптимизация и стандартизация метода культивирования имеют решающее значение.
Создание линий hESC было впервые описано с использованием МЭФ в качестве фидерных клеток и культуральной среды, содержащей фетальную телячью сыворотку (FBS)2. В дальнейшем FBS была заменена на KnockOut Serum Replacement (KSR) и FGF2, что способствует усилению пролиферации hESCs3. В конечном итоге системы бесфидерного культивирования позволили выращивать клетки на планшетах, покрытых Matrigel, в кондиционированной среде с содержанием KSR (среде, кондиционированной МЭФ)4. Впоследствии условия культивирования hESCs сместились в сторону бесфидерного культивирования в химически определенных условиях5-7. Более того, для предотвращения потенциального загрязнения патогенами и белками животного происхождения были разработаны методы культивирования с использованием ксено-свободных компонентов8.
Для оптимизации условий культивирования фидерные клетки мыши были заменены на человеческие клеточные линии (например, клетки плода мышц и кожи9, клетки кожи взрослого человека10, фибробласты крайней плоти11-12, амниотические мезенхимальные клетки13). Однако эффективность поддержания недифференцированных hESCs при использовании фидерных слоев на основе фибробластов крайней плоти человека не так высока, как при использовании фидерных клеток мыши, что обусловлено более низким уровнем секреции Activin A14. Очевидно, что существует заметная разница в продукции факторов роста фидерными клетками мыши и человека.
Анализ транскриптомов фидерных клеток мыши и человека выявил значительные различия между поддерживающими и неподдерживающими клетками. Экзогенный FGF2 имеет решающее значение для поддержания способности hESCs и hiPSCs к самообновлению и был определен как ключевой фактор, регулирующий экспрессию Tgfβ1, Activin A и Gremlin (антагониста BMP) в фидерных клетках. Было показано, что Activin A индуцирует экспрессию OCT4, SOX2 и NANOG в hESCs15-16.
Для длительного культивирования hESCs и hiPSCs можно выращивать на митотически инактивированных MEFs или в бесфидерных условиях в MEF-CM (среде, кондиционированной MEF) на планшетах, покрытых Matrigel, чтобы сохранить их недифференцированное состояние. Успех обоих вариантов культивирования полностью зависит от качества фидерных клеток, так как они напрямую влияют на рост hESCs.
В данной работе представлен оптимизированный метод выделения и культивирования эмбриональных фибробластов мыши (MEF), приготовления кондиционированной среды (CM) и проведения иммуноферментного анализа (ELISA) для оценки уровней Activin A в средах.
Протокол
1. Выделение эмбриональных фибробластов мыши (MEFs)
В следующих двух шагах выполняются, не связанных с асептических условиях.
- Пожертвуйте беременных мышей (CF1, Харлан, США) на 13 или 14 DPC (день после coitum) от шейки дислокации.
- Проанализируйте из рога матки, кратко промыть в 70% (объем / объем) этанола и место в трубку сокол содержащей PBS без Ca 2 + Mg 2 + (Gibco, Invitrogen).
Следующие шаги осуществляются в капюшоне культуры ткани в асептических условиях и с помощью стерильных инструментов.
- Поместите рога матки в чашку Петри и отделить каждый эмбрион от плаценты и эмбриональных мешка.
- Проанализируйте головы и красных органов, умойся в PBS и поставить все эмбрионы в чистую чашку Петри. Мелко рубите ткани, используя стерильные лезвия, пока не станет возможным пипетки.
- Добавьте 1 мл 0,05% трипсин / EDTA (Gibco, Invitrogen), вклюДин 100 Куниц единиц ДНКазы I (USB), в зародыше.
- Передача ткани в 50 мл трубку сокол и инкубировать в течение 15 мин при 37 ° C. После каждых 5 мин инкубации клеток отделить с помощью пипетки вверх и вниз тщательно.
- Инактивируют трипсин, добавив около 1 объема свежеприготовленного MEF среды.
MEF питательной среды (компоненты, чтобы сделать 500 мл средства массовой информации, смешать все компоненты и фильтр):
450 мл DMEM, 50 мл FBS (10% (об. /)), 5 мл 200 мМ L-глутамина (1/100 (V / V)), 5 мл пенициллина, стрептомицина (1/100 (V / V)). - Центрифуга клеток с низкой скоростью (300 мкг), 5 мин, осторожно удалите супернатант и ресуспендируют осадок клеток в теплую среду MEF.
- Плиты приблизительно количество клеток, что эквивалентно 3-4 эмбрионов в каждом T150 (ТЭС) колбы покрыты 0,2% желатина (желатин из бычьей кожи, тип B, Sigma) в течение 2 часов. Фибробластов (P0, прохождение 0) являются единственными клетками, которые имеют возможность присоединить к желатин покрытием колбы.
- В идеале, клеток 80-90% сливной после 24 часов и на данном этапе большая часть P0 клеток замораживается для использования в будущем.
- Разверните оставшиеся T150 колбу (ы) P0 клетки до P3 и P4, то инактивировать и использовать в качестве питателей для replate ЭСК или для получения кондиционной среды (КС).
2. Инактивация и покрытие MEFs (подготовка фидерных клеток)
Все этапы проводятся в капюшоне культуры ткани в асептических условиях.
- Пальто T150 колбы с 0,2% желатина и инкубируют при комнатной температуре в течение 2 часов.
- Развести митомицина в PBS (1 мг / мл) и фильтр.
- Аспирируйте информации из MEFs и промыть PBS без Ca 2 + Mg 2 +.
- Место 20 мл среды, содержащей 10 мкг / мл митомицина на MEFs.
- Выдержите в течение 2 часов при температуре 37 ° С, митомицин С, содержащие средние затем промыть два раза PBS, trypsinize, центрифуга (в течение 5 мин при 300 мкг) и ресуспендирования клеток в теплой среде.
- Граф клеток и пластины с плотностью 56,000 клеток / см 2 в T150 колб и использовать для СМ производства на следующие 6 дней.
3. Условный средний (СМ) Подготовка
Все этапы проводятся в капюшоне культуры ткани в асептических условиях.
- На следующий день после нанесения покрытия инактивированной MEFs при плотности 56,000 клеток / см 2 заменить MEF среде с чЭСК среды (UM, безусловный среды) (0,5 мл / см 2) дополнить недавно с 4 нг / мл FGF2.
- Соберите см от подачи колбы после 24 ч инкубации и добавить свежую среду чЭСК, содержащий 4 нг / мл FGF2 в кормушки.
- Повторите эту процедуру в течение последующих 6 дней. Каждый день магазин собрал CM при температуре -20 ° C.
- Через 6 дней смешать все порции средней и фильтр (Corning, 0,22 мкм, PAS). Сделайте 50 мл аликвоты и хранят при температуре -80 ° C.
- Дополнение CM с дополнительными 4 нг / мл FGF2 перед добавлением ЭСК выросли на Матригель.
4. Измерение активин в кондиционированной среде (ИФА) 15
- Доведите все образцы и реагенты до комнатной температуры.
- Развести захватить антител (Human \ Мыши \ Крыса Активин MAb, R & D Systems) в PBS с 1% BSA, добавить в планшет (100 мкл / лунку) и инкубировать в течение ночи при комнатной температуре.
- Через 24 часа промыть лунки три раза PBST (PBS с 0,05% Твин-20) (300 мкл / лунку), то блок (1% BSA / PBS, 300 мкл / лунку) в течение 1 часа при комнатной температуре.
- В это время подготовить Активин (R & D Systems) калибровочной кривой, в том числе 7 разведения (концентрация менее 30 нг / мл) и пустой образца. Линейный рабочий диапазон Активин между 0,25 и 32 нг / мл.
- Добавить дубликатов стандартов и образцов в лунки (100 мкл / лунку) и инкубировать в течение 2 часов при комнатной температуре.
- Вымойте скважин в три раза (300 мкл PBST).
- Добавить вторичных (биотинилированного) антител (человек / мышь / крыса биотинилированный Активин MAb, R & D Systems) (0.25 мкг / мл в 1% BSA / PBS) и инкубировать в течение 2 часов при комнатной температуре.
- Вымойте скважин в три раза (300 мкл PBST), добавьте стрептавидином-HRP (разводят в 1% BSA / PBS, R & D Systems) и инкубировать в течение 20 мин при комнатной температуре.
- Вымойте скважин в три раза (300 мкл PBST), добавьте 100 мкл раствора субстрата (Quantikine, R & D Systems) и инкубировать 30 минут при комнатной температуре в темноте.
- Добавить 100 мкл стоп-раствора (Quantikine, R & D Systems) в каждую лунку и аккуратно перемешать.
- Установить микропланшетов читателя (Molecular Devices спектры Max 250, Global медицинской техники, Inc, штат Миннесота) до 450 нм, с длиной волны коррекции на 540 или 570 нм, определить оптическую плотность каждой лунки.
5. Представитель Результаты
Общая схема выделения процедура представлена на рисунке 1. Типичная морфология и ЭСК hiPSCs культивировали при различных условиях представлена на рисунке 2. Морфология MEFs и инактивированных клеток фидерных использованы для подготовки CM представлена на рисунке 3. В общем, камеры должны быть вырожденным 24 часов после изоляции и готова быть заморожены или расширена. Тем не менее, иногда это может занять 2-3 дня до получения сливной культур. СМ должны быть приготовлены из клетки при прохождении 4 и не позже. Это очень важно, потому что первичные клетки могут быть расширены за 4-5 проходов до начала старения.
Цитокинов, Активин, рассматривается как наиболее важный фактор выделяется фидерных клеток для поддержки роста недифференцированных плюрипотентных клеток 14. Измерение уровня активин в см (рис. 4) представляет собой очень удобный количественного анализа для контроля качества MEFs.
Рисунок 1. Схематическое изображение процедуры изоляции MEFs.
Рисунок 2. Типичная морфология недифференцированных ЭСК культивировали в присутствии (A) фидерных клеток (B) кондиционированной среды и (C) определенной среде. Типичная морфология hiPSCs культивировали в присутствии (D, E) клетки фидера.
Рисунок 3. Типичная морфология эмбриональных фибробластов мыши (MEFs). () Прохождение 0 (P0) через два дня после покрытия / изоляции, (B) инактивированная слой подачи при плотности 56,000 клеток / см 2.
Рисунок 4. Иммуноферментного анализа (ИФА) на основе измерения концентрации активин в кондиционированной среде (CM) пр.epared с мышиных эмбриональных фибробластов, полученных из CF1 штаммом мыши. CM была собрана в течение 6 дней, а затем объединяются. CM "1" и СМ "2" относятся к разным партиями средств массовой информации и единой для безусловного СМИ. В функции кондиционирования процесс активин секреции в среду на MEFs, Активин это практически невозможно обнаружить в UM.
Обсуждение
Процедура MEFs изоляции, представленные здесь позволяет создание стандартизированных условиях культуры ЭСК и hiPSCs. Кроме того, ИФА-системы, используемые для оценки продукции цитокинов фидерных клеток является полезным индикатором качества MEF-производных условно СМИ. Текущий ремонт мыши штамма (CF1) обеспечение поддержки фибробластов необходимо, чтобы избежать от партии к партии изменении медиа-культуры. Кроме того, рекомендуется изолировать от нескольких эмбрионов мышей одновременно получить стабильное качество клеток. Конечно свежевыделенных MEFs может быть заморожен на P0 и P1. Также инактивированной MEFs можно хранить в замороженном состоянии в аликвоты соответствующих сумм в зависимости от требований к клеточной культуре. Обычно около 250,000 клетки должны быть покрыты в одном и 6-луночного планшета для культуры ЭСК и иПК клеток. Создан и оптимизирован метод может быть широко используется, чтобы минимизировать изменчивость между Diff #Аренда экспериментов.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Особая благодарность доктору Борису Greber для создания Активин ИФА протокол, опубликованной в Greber соавт. 2007 года. Мы особенно благодарны г-жа Моника Shevack подготовки графическое представление. Мы очень благодарны доктору Хайко Фукса за помощь и ценные советы перед и во время съемок. Мы хотели бы поблагодарить всех членов лаборатории Аджайе, особенно Элизабет Socha для поддержания постоянного притока MEFs и CM. Мы также признаем, наши коллеги на животных средство MPIMG за постоянную поддержку. Эта работа была частично финансируется за счет Общества Макса Планка и [BMBF, грант № 0315717A], партнеров ERASysBio + инициатива поддерживается в ЕС ERA-NET Plus схемы FP7.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Название реагента | Компания | Номер по каталогу | Комментарии |
| DMEM (высокая глюкоза) | Gibco, Invitrogen | 41966-052 | |
| FBS | Biochrom | S0115 | |
| L-глютамин | Gibco, Invitrogen | 25030-024 | |
| Пенициллин, стрептомицин | Gibco, Invitrogen | 15140-122 | |
| Вакуумные фильтры | Гранулирование | 431097 | 500 мл, 0,22 мкм, PAS |
| ДМСО | Сигма | D2650 | |
| Нокаут DMEM | Gibco, Invitrogen | 10829-018 | |
| Нокаут SerЗамена мкм | Gibco, Invitrogen | 10828-028 | |
| Номера для незаменимых аминокислот | Gibco, Invitrogen | 11140-035 | |
| Бета-меркаптоэтанол | Сигма | M7522 | |
| PBS | Gibco, Invitrogen | 14190-169 | |
| ДНКазы I | Сигма | D4527 | |
| Митомицин C | Roche | 10107409001 | |
| Основной фактор роста фибробластов | PeproTech | 100-18B | |
| Биотинилированные Anti-human/mouse/rat Активин антител | R & D Systems | BAM3381 | |
| Желатин | Сигма | G9391 | |
| Человек / мышь /Крысы Активин MAb | R & D Systems | MAB3381 | |
| 0,05% Трипсин-EDTA | Gibco, Invitrogen | 25300-054 | |
| Дополнительные тонкие Ножницы Iris | FST | 14088-10 | |
| Ультра тонкие щипцы Грефе | FST | 11150-10 | |
| Pierse щипцы фиксации | FST | 18155-13 |
Ссылки
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Thomson, J. A. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Amit, M. Clonally derived human embryonic stem cell lines maintain pluripotency and proliferative potential for prolonged periods of culture. Dev. Biol. 227, 271-278 (2000).
- Xu, C. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).
- Ludwig, T. E. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nat. Biotechnol. 24, 185-187 (2006).
- Yao, S. Long-term self-renewal and directed differentiation of human embryonic stem cells in chemically defined conditions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 6907-6912 (2006).
- Lu, J., Hou, R., Booth, C. J., Yang, S. H., Snyder, M. Defined culture conditions of human embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 5688-5693 (2006).
- Skottman, H., Hovatta, O. Culture conditions for human embryonic stem cells. Reproduction. 132, 691-698 (2006).
- Richards, M., Fong, C. Y., Chan, W. K., Wong, P. C., Bongso, A. Human feeders support prolonged undifferentiated growth of human inner cell masses and embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 20, 933-936 (2002).
- Richards, M. Comparative evaluation of various human feeders for prolonged undifferentiated growth of human embryonic stem cells. Stem Cells. 21, 546-556 (2003).
- Amit, M. Human feeder layers for human embryonic stem cells. Biol. Reprod. 68, 2150-2156 (2003).
- Inzunza, J. Derivation of human embryonic stem cell lines in serum replacement medium using postnatal human fibroblasts as feeder cells. Stem Cells. 23, 544-549 (2005).
- Zhang, K. Utilization of Human Amniotic Mesenchymal Cells as Feeder Layers to Sustain Propagation of Human Embryonic Stem Cells in the Undifferentiated State. Cell Reprogram. , (2011).
- Eiselleova, L. Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells. Int. J. Dev. Biol. 52, 353-363 (2008).
- Greber, B., Lehrach, H., Adjaye, J. Fibroblast growth factor 2 modulates transforming growth factor beta signaling in mouse embryonic fibroblasts and human ESCs (hESCs) to support hESC self-renewal. Stem Cells. 25, 455-464 (2007).
- Vallier, L., Alexander, M., Pedersen, R. A. Activin/Nodal and FGF pathways cooperate to maintain pluripotency of human embryonic stem cells. J. Cell Sci. 118, 4495-4509 (2005).
Перепечатки и разрешения
Теги
