Использование Цистометрия в мелких грызунов: исследование мочевого пузыря Chemosensation

Summary

Цистометрия является эффективным методом для оценки функции мочевого пузыря мелких животных В естественных условиях. Мочевой пузырь постоянно переплетаются со скоростью управляется через внутрипузырного катетер, в то время как мочеиспускательный канал остается свободным для мочеиспускания. Это позволяет для повторного наполнения и опорожнения мочевого пузыря, в то время как внутрипузырного давления и объема мочеиспускания записываются.

Protocol

1. Лабораторных животных

1. Животных (мышей, крыс) размещаются в специализированном лечебном учреждении животных с 12-час цикле свет-темнота и вволю доступ к воде и стандартных гранул пищи. Оба пола и возраста животных являются важными параметрами, которые должны быть стандартизированы в соответствии с потребностями. Мы обычно выполняют цистометрии в 10 - 12 недельных самок ^5,6.
2. Все эксперименты на животных проводятся в соответствии с Европейским Союзом принципы сообщества совета и одобрен местным комитетом по этике.

2. Анестезия

1. Isoflurane анестезии используется для выполнения небольших хирургических процедур, так как он легко дозы в связи с его коротким периодом полураспада. Соответствующие очистки отходящих газов необходимо при использовании изофлурана.
   1. Животных помещают в фургон, газом изофлураном 5% в чистом кислороде (1 л / мин).
   2. После индукции анестезии при соответствующем лEvel поддерживается небольшой маски (разрез 10 мл шприц) на 0,8 - 1 л / мин кислорода с 1 - 1,5% изофлурана.
2. Для мышей, уретановые анестезия применяется при функциональных записи (ср. ниже). Уретановые анестезия применяется при функциональных записей, потому что, в отличие от большинства других анестетиков, рефлекс мочеиспускания не подавляется этого анестетика ^4. Уретановые 1,2 г / кг массы тела вводят подкожно (п) 60 мин до начала записи. При необходимости дозу уретана, необходимых для получения надлежащей анестезии можно титровать путем введения дополнительных доз (0,1 г / кг) подкожно. Следует отметить, однако, что дополнительная анестезия может изменить мочеиспускания эффективности и, следовательно, частоты мочеиспускания ^7,8. Таким образом, цистометрической записи необходимо внимательно следить и отбрасываются, когда значительные отклонения от контроля поведения не наблюдается. Анестезия не следует назначать в то время как тестсоединения применяются, чтобы избежать неправильного толкования данных.

3. Хирургическая процедура - мочевой пузырь катетер Имплантация

1. Хирургические инструменты стерилизуются в автоклаве перед использованием. Бритье живота животных, дезинфицируют спиртом 70% и выполняют лапаротомию низкой средней линии, чтобы разоблачить мочевого пузыря.
2. Под операционным микроскопом, поместить кисетный шов в мочевой пузырь купола используется не рассасывающиеся, мононить шва (размер 6-0).
3. Выполните небольшое цистостомии (мы преимущественно использовать иглу 18 G) внутри кошелька строку и вставьте PE 50 полиэтиленовый катетер, с небольшим манжеты на конце (получено тщательно нагрева трубы) через это отверстие. В наши руки, тонкие трубы (ПЭ 10) имеют более высокие и переменного сопротивления. Трубка может быть вылечен, поместив ее в этанол 70% раствора или стерилизовать в автоклаве. Перед имплантацией, трубы следует промыть раствором.
4. Закрепите кошелек улING вокруг трубы с узлом хирурга. Вытяните катетер осторожно наружу, пока колоколообразной конец находится прямо под шов. Нажмите кусок катетера 18 G к швом, чтобы предотвратить утечку.
5. Настаивать небольшой объем физиологического раствора (100 - 200 мкл) осторожно, чтобы проверить на герметичность. Если утечка присутствует, дополнительный шов должен быть помещен.
6. Закрыть мышцы живота использовании мононити швы, оставляя проход для катетера в верхней части разреза.
7. Туннель трубку к межлопаточной области использования полых металлический стержень, тем самым предотвращая животные кусают трубки во время эксперимента.
8. Кожа закрывается с помощью нерассасывающийся, швы мононити. Имплантирован катетер промывается физиологическим раствором, чтобы проверить его проницаемость.
9. Перед животные пробуждаются, анальгетики подкожно (бупренорфин, 0,05 мг / кг).

4. Установка и Цистометрия

1. В зависимости от экспериментальной Questiна (и видов, используемых) цистометрии выполняется в бодрствования (ограничения или необузданность) или уретана анестезии животных. В то время как цистометрии вполне возможно в сознании крыс, которые имеют тенденцию оставаться спокойным в сдержанной окружающей среды, мы обычно выполняют цистометрии под уретана анестезии (1,2 мг / кг, подкожно) при использовании мыши ^3,5,6,9.
2. В наркозом мышей, температура тела постоянно контролируется и поддерживается на 36,5 ° C ± 0,2 ° C с помощью датчиков температуры и нагрева лампы.
3. Настройки калибруется перед каждым экспериментом в соответствии с инструкциями производителя.
4. Имплантирован катетер связано с тем, Luer заглушки для 3-х ходовой кран, который подключается к датчику давления (Edwards Lifesciences) с одной стороны и инфузионного насоса на другой (Harvard Apparatus). Датчик давления подключен через усилитель (78534c монитор, Hewlett Packard) к системе сбора данных (DI-730-USB, Dataq инструментов) и сотрудничествоmputer. Windaq / Lite программное обеспечение можно использовать для записи.
5. Настой насос, что позволит вливание физиологического раствора или в PBS, например, 100 мкл / мин (у крыс) или 20 мкл / мин (у мышей). В таких мочевого пузыря будет заполнена с постоянной скоростью, в то время внутрипузырного давления записывается.
6. На рисунке 5 показаны типичные следы давления: во время инфузии жидкости, происходит медленное наращивание давления в мочевом пузыре, пока определенный объем / давление будет достигнуто, мочеиспускание порог. Как только этот порог будет достигнут, мочевого пузыря, будет сжиматься, а затем сфинктера откроется, позволяя прохождение мочи через мочеиспускательный канал. Таким образом, мочевой пузырь опорожняется, сокращение остановится, и давление упадет еще раз, чтобы "базальных" уровне.
7. Как крыс помещали в метаболические клетки и выше цифровые баланса, объема мочеиспускания могут быть измерены одновременно, давая информацию о объема мочеиспускания. Из-за небольших объемов аннулирована в мисе, она может быть очень сложным использованием этой системы. Таким образом, объема мочеиспускания определяется с помощью небольшого фильтровальной бумаги взвешиваться до и после мочеиспускания.
8. Как правило, мы позволяем системе равновесия в течение 30 мин, после чего запись в течение 30 мин. Тогда, наркотики можно вводить системно или внутрипузырно и еще 30 мин записываются.
9. Записанные данные могут быть экспортированы в. CSV-файлов, которые можно импортировать в специализированное программное обеспечение для количественного анализа. Обычно мы используем происхождения (OriginLab корпорации, штат Массачусетс, США).
10. После экспериментов животных умерщвляют путем смещения шейных позвонков (мышей) или CO ₂ интоксикации (крысы).

5. Представитель Результаты

Рисунок 1. Лапаротомия обзор. А) Поместите крысу в положении лежа на спине. B) бритья и стерильно готовить хирургическое сайта. C) разрез кожи. D) Разрез оF мышцы живота и мочевого пузыря экспозиции.

Рисунок 2. Кисетный шов.

Рисунок 3. Катетер имплантации.

Рисунок 4. Туннелирование катетер.

Примеры измерения давления, полученные в ходе внутрипузырного перфузии физиологического раствора в сознательном крыс и мышей под наркозом показано на рисунке 5. Несколько параметров можно извлечь из сигнала давления (например, intercontractile интервал, базовый давления и порог давления). Для всестороннего описания этих параметров см. Andersson и соавт. (Ссылка 4) и Yoshiyama и соавт. ( Ref 10).

Недавно мы использовали цистометрии для идентификации молекулярных мишеней горчичное масло (MO), высокой реакционной способностью соединения, которое уже давно используется в экспериментальных моделей воспаления и гипералгезии внутренних органов, таких как мочевой пузырь ^11,12. Внутрипузырная инфузии 10 ммоль MO вызывали сильное увеличение частоты мочеиспускания (снижение intercontractile интервала) у мышей дикого типа (рис. 6а, б) и уменьшение объема мочеиспускания ^6. Интересно, MO индуцированных подобных изменений у мышей, дефицитных по рецептору MO TRPA1. В отличие, MO индуцированных гораздо слабее изменений в цистометрической параметров в TRPV1 мышей KO, чем в WT мышей и был без эффекта в Trpa1/Trpv1 мышей KO. Вместе с измерениями выпуска геном кальцитонина пептид, связанный с (CGRP) ^6, эти данные показывают, показывают, что TRPV1 может играть ключевую роль в висцеральной раздражение индуцированных МО.

ve_content ">
Рисунок 5. Представитель следы внутрипузырного давления, записанные в сознательном самок крыс (А) и в анестезии женщина мыши (B). Самое низкое давление определяется как "базовый давления" (красные стрелки). Давление в конце фазы заполнения отмечены синими стрелками. Объем введенной жидкости между этими точками, деленной на разность давлений, позволяет рассчитать соответствие стенки мочевого пузыря (соблюдение = придают объем / (пороговое давление -. Базового давления) "intercontractile интервал" (ICI) это время между два мочеиспускания сокращений.

Рисунок 6. Эффекты внутрипузырного применения горчичного масла на цистометрии картины в дикого типа и мышей TRPA1, TRPV1 и Trpa1/Trpv1 нокаутом.(A) Характерные примеры внутрипузырного изменения давления, записанные в WT, TRPA1 KO, KO TRPV1 и Trpa1/Trpv1 KO мышей в ответ на вливание физиологического раствора и 10 мМ МО. (B) Время курса средней мгновенной частоты мочеиспускания до и во время внутрипузырного вливания МО. Для всех мышей, данные были нормированы на средней частоты, полученные в ходе вливание физиологического раствора. Эти данные адаптированы из Everaerts и соавт. (Ссылка 6), с разрешения Elsevier.

Discussion

Цистометрии техники, представленные здесь позволяет проводить в естественных условиях измерения функции мочевого пузыря на животных моделях. Крысы являются, вероятно, наиболее часто используемые модели на животных. Мыши сложнее в использовании, но имеют преимущество использования генетически модифицированных животных. Из-за технических трудностей использования сознательного мышей, которые, как правило, очень активны в результате ослабления имплантировали катетер и изменения в внутрибрюшное давление, что может п...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Коммерческое имя, название компании,	Номер в каталоге	Комментарии
уретан	Уретановые, Sigma-Aldrich	315419	Группа 2B канцерогенных
изофлуран	Isoba, Schering-Plough Animal Health
полиэтиленовый катетер	Intramedic полиэтиленовые трубы PE50, Becton Dickinson	427411
Операционный микроскоп	Op-Mi 6, Carl Zeiss	Op-Mi 6
кисетный шов	Prolene 6/0, Ethicon	8610H
фасции и кожу шва	Ethilon 4/0 или 5/0, Ethicon	662G и 661G
послеоперационных анальгетиков	Temgesic, Schering-Plough Animal Health		Дозировка для крыс: 0,05 мг / кг
усилитель	78534c монитор, Hewlett Packard
аналитический баланс и баланс сбора данных программное обеспечение	ФЗ 300i, D &	FZ-300i
инфузионные насосы	насос 33, Гарвардский аппарата	HA33
Система записи цистометрии	Dataq инструментов, DI-730 серии и Windaq / Lite	DI-730-USB Windaq / Lite
Температура регистрации	Fluke 52 Термометр KJ	52 KJ
Датчики давления	Edwards Lifesciences, набор контроля давления	T322247A