Сексуальные кресты и изоляции рекомбинантного потомства являются важным инструментом исследования для нитчатых грибов, Fusarium graminearum Методам необходимо успешно осуществлять эти процессы представлены.
Методическая статья
Сексуальное развитие и аскоспор разряда в Fusarium graminearum
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Fusarium graminearum стал модельной системой для изучения развития и патогенности нитевидных грибов. F. graminearum легче всего образует плодовые тела, называемые перитециями, на морковном агаре. Перитеции содержат многочисленные типы тканей, которые образуются на определенных стадиях развития перитеция. К ним относятся (в порядке появления): формирование зачатков перитеция (из которых развиваются аскогенные гифы), внешняя стенка, парафизы (стерильный мицелий, занимающий центр перитеция до развития сумк), сумки и аскоспоры внутри сумок14. Развитие каждой из этих тканей разделено примерно 24 часами, что послужило основой для транскриптомных исследований в ходе полового развития12,8. Более подробное описание развития, включая фотографии каждой стадии, приведено в работе Hallen et al. (2007). Здесь мы представляем методы получения и сбора синхронно развивающихся газонов перитециев для временных исследований регуляции генов, развития и физиологических процессов. Хотя эти методы написаны специально для использования с F. graminearum, данные техники могут быть применены к различным другим грибам, при условии, что плодоношение может быть индуцировано в культуре и наблюдается определенная синхронность развития. Недавно мы адаптировали этот протокол для изучения полового развития F. verticillioides. Несмотря на то, что у этого вида отдельные перитеции приходится отбирать вручную, так как индуцировать газоны развивающихся перитециев не удалось, данный процесс хорошо зарекомендовал себя при изучении развития (Sikhakolli and Trail, неопубликованные данные).
Основной функцией плодовых тел грибов является распространение спор. У многих видов Ascomycota (грибов, образующих сумки), споры выстреливают из сумки вследствие создания тургорного давления внутри нее, что приводит к выбросу спор (и эпиплазматической жидкости) через пору на верхушке сумки2,7. Наши исследования принудительного выброса аскоспор привели к разработке «анализа выброса спор», который мы используем для скрининга мутаций в этом процессе. Здесь мы представляем подробное описание данного анализа.
F. graminearum является гомоталличным грибом, и поэтому может образовывать плодовые тела в отсутствие совместимого партнера. Преимущество гомоталлизма заключается в том, что для получения потомства, гомозиготного по определенному признаку, скрещивание не требуется, что облегчило изучение полового развития этого вида14,7. Тем не менее были созданы гетероталличные штаммы, которые можно использовать для скрещивания5,9. Также возможно скрещивать гомоталличные штаммы для получения мутантов по нескольким генам в одном штамме1. Это осуществляется путем совместной инокуляции одной чашки Петри двумя штаммами. В месте их соприкосновения большинство перитециев будут рекомбинантными (при условии, что мутация в одном из родительских штаммов не подавляет ауткроссинг). По мере созревания перитеции выделяют аскоспоры массово, а не выбрасывают их принудительно. Получаемый экссудат спор (называемый циррусом) скапливается на кончике перитеция и может быть легко удален для выделения отдельных спор. Здесь мы представляем протокол, облегчающий идентификацию рекомбинантных перитециев и выделение рекомбинантного потомства.
Протокол
1. Производство Перитеции
- Центр прививки морковь агар 10 в 6,0 см диаметр чашки Петри с плодородной штамма F. graminearum (рекомендуется PH-1).
- Место привиты блюда под яркой лампы дневного света при комнатной температуре (18-24 ° С) и позволяют расти, пока мицелий достигает внешнего края чашки Петри (3-5 дней). Коммерческая бытовых люминесцентных ламп прекрасно работать для стимулирования плодоношения формирования тела и разряда.
- Аккуратно снимите воздушный мицелий стерильным зубочисткой.
- Распространение 1,0 мл 2,5% Tween 60 AQ на поверхность стерильным hockeystick стекла или закругленный конец стерильной стеклянной палочкой.
- Вернуться пластин на свет. Не добавляйте к парафильмом пластин.
- После 24 часов, на поверхности пластин должна иметь блестящий внешний вид. Если мицелий появляется, поверхностные царапины и повторно применить твин-60 решение.
- Соблюдайте развития перитеции в течение следующей недели. Промежуточных стадияхperithecium развития могут быть собраны, мягко очищая поверхность агара и флэш заморожены для выделения РНК (рис. 1).
- Зрелые споры будут накапливаться на крышке пластинки в день 7. Первоначально это будут видны только под микроскопом рассечения, но 9-й день, они накопили достаточной плотности, чтобы быть видимыми невооруженным глазом.
2. Аскоспор разряда Пробирной
- На 6-й день после нанесения раствора Tween, нарезать 1 см диаметр круга из агара с дерева сверло. Кроме того, скальпель может быть использован для удаления такого же размера сегмента. Круг может быть нарезанный пополам и каждую половину помещают на предметное стекло микроскопа стекло.
- Восток куски так, поверхность, содержащую плодовые тела перпендикулярно к поверхности слайда, а также споры уволен по всей длине затвора.
- Поместите слайд в камере влажности в течение ночи в свет. Споры будут накапливаться наскольжения и быть видимыми невооруженным глазом на следующее утро (рис. 2).
- Накопленный споры могут быть смыты водой слайдов и количественно, если это необходимо.
- Потенциальные аскоспор ингибиторов разряда могут быть проанализированы, добавив их в обратную сторону агара при сборке блока анализа. Некоторые ингибиторы ионных каналов, которые снижают разряд ранее анализировали с помощью этой техники 15.
3. Генерация рекомбинантного потомства
- Начать пересекать путем посева моркови агар с двумя штаммами F. graminearum (один Nit + и один-нит), поставив прививку точек на противоположных сторонах чашки Петри.
- После гифы заполнили поверхность, соскрести воздушной части и применить твин-60 решение, как описано выше. Используйте маркер, чтобы отметить на стороне чашки Петри, где гифы с концами.
- Вернуться культуры к свету и инкубировать до перитеции разработали и cirrhi были бытьпистолет для формирования из перитеции по линии пересечения двух культур.
- При вскрытии микроскоп, привести в просмотр перитеции по линии пересечения двух культур. Использование насекомых контактный, стерилизуют и опускают в стерильную воду, трогать cirrhus вдоль этой границы легко кончиком пальца. Влажность на выводе должно позволить cirrhus придерживаться выводов.
- Промойте кончик штифта с cirrhus на нем в 200 мкл стерильной воды в пробирку Эппендорфа мыть спор с.
- Пламя вывод, смочите его снова и выбрать другой cirrhus. Выберите от 10 до 15 cirrhi, и поместить каждый в отдельную пробирку с водой.
- Кратко вихревых труб, содержащих взвешенные cirrhi.
- Удалить 60 мкл суспензии спор с помощью пипетки и место на ММТС среды 1 в 9 см блюдо Петри. Распространение стерильным хоккейной клюшкой. Остальные подвески спор может храниться при температуре 4 ° С до недели и replated если это необходимо.
- Инкубациите при комнатной температуре (свет не обязательно) в течение 3-5 дней, пока очень небольшие колонии (Рисунок 3). Там будет два вида фенотипов среди колоний. Нит-колоний будет редким, чем гиф колоний Nit +. Cirrhi из рекомбинантных перитеции покажет как колония фенотипов примерно в равных пропорциях. Откажитесь от пластин с колониями только одного фенотипа на них. Обратите внимание, что иногда более чем в два фенотипа привести в связи с разделение других факторов.
- Перемещение колонии V8 или морковный агар для хранения. Испытание колонии на Dox агар Чапека (нит-штаммы не будут расти на Dox Чапека) и на КПК с хлорат (0,5 М хлорат калия, Nit штаммов + не будет расти на КПК с хлорат), чтобы подтвердить правильность фенотипа. Изучите эти колонии для желаемого качества.
4. Представитель Результаты
Производство перитеции
Цель состоит в том, чтобы газонперитеции без мицелия или спор очевидной. Поверхность культуры будет похож на черный бархат (рис. 1). В 24 часов после применения Tween поверхности агара должны быть легким блеском. Если мицелии появляются, то плита не может быть Царапины достаточно, чтобы вызвать perithecium развития.
Аскоспор разряда
Всегда предоставлять в анализе нескольких блоков агар от штамма дикого типа. Если те, не срабатывают, то либо ваш перитеции слишком молод или слишком стар. Если они слишком старые, то многочисленные гифы появится на поверхности культуры придав ему беловатый оттенок. Если это не так, они могут быть слишком молоды, и анализа должны быть вновь в 24 час. Иногда, культуры не выполнять хорошо, и эксперимент придется повторить. Убедитесь, что вы выполните тест при определенных условиях освещения.
Рекомбинантный потомство
Рекомбинантного перитеции должны составлять большинство перитеции по линии пересечения двух штаммов. Мы обычно перерабатывать до 10 cirrhi с креста и по крайней мере 4-6 из тех, должны быть рекомбинантные. Очень редко, мутация препятствует деформации от спаривания. Если один из родителей имеет фенотип аберрантных роста, то более чем в 2 фенотипы могут присутствовать среди колоний на ММЦ.
Рисунок 1. Этапы развития perithecium на морковь агара. Левые, 72 ч после применения Tween. Обратите внимание, красный пигмент, и очень молодые перитеции видны как черные зерна на поверхности. Да, на 144 ч, зрелые перитеции сформировались. Обратите внимание, почти полное отсутствие поверхностного мицелия в обеих культурах.
Рисунок 2. Разряда анализа. Оранжевый разъем агар морковь ориентирован так, тхат спор принудительно выписали из зрелых перитеции на ее поверхности может накапливаться на поверхности стекло. 15 часов времени накопления.
Рисунок 3. Различия в росте между Nit + и нит-колоний на селективной среде ММЦ. Нит-колоний (наконечники стрел) меньше. Нить + колоний (стрелки) показывает устойчивый рост. Фотография сделана через 7 дней.
Обсуждение
Ф. graminearum особенно хорошо приспособлены к изучению плодоношения развитие тела в связи с наличием хорошо аннотированного генома ( mips.helmholtz-muenchen.de/genre/proj/FGDB / 4), а также наличие Affymetrix- основанный микрочипов 6. Это способствовало возможность идентифицировать гены, важные для аскоспор разряда 7,11,3. Методы, представленные здесь, позволяют исследователю сосредоточиться на дискретный набор этапов развития и функций для генетического анализа плодовых тел F. graminearum. Эти методы также легко адаптируется к связанным грибов, которые могут быть вызваны на фрукты в культуре, и может быть использован в качестве стандарта для развития целого ряда других грибковых типов тела плодоношения.
Способность оценивать фенотип стрельбы спор может быть тонким в вид, где споры малого и трудно понять, например, F. graminearum. Коллекция спор на чистую слайд облегчает и визуальной оценки и количественная оценка, так как споры могут быть смыты слайдов и количественно. Некоторые виды грибов производят слизь, которая окружает их споры и споры не могут быть смывается, но должны учитываться микроскопически они остаются на слайде. Мы нашли, что это верно Sclerotinia sclerotiorum.
Раскрытие информации
Нам нечего раскрывать.
Благодарности
Эта работа была поддержана грантом от Национального научного фонда (MCB-0923794 для FT).
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Название реагента | Компания | Номер по каталогу | |
| Fusarium graminearum штамм PH-1 | Грибковые генетики со Центр, Канзас | FGSC 9075 | |
| Tween 60 | Sigma-Aldrich | P1629 | |
| Dox Чапека агар | Difco, Becton Dickinson | 233810 | |
| Хлорат калия | Sigma-Aldrich | 255572 |
Ссылки
- Bowden, R. L., Leslie, J. F. Sexual recombination in Gibberella zeae. Phytopathology. 89, 182-188 (1999).
- Buller, A. H. R. Researches on Fungi. , Longmans, Green and Co. London, England. (1909).
- Cavinder, B., Hamam, A., Lew, R. R., Trail, F. Mid1, a mechanosensitive calcium ion channel, affects growth, development, and ascospore discharge in the filamentous fungus Gibberella zeae. Eukaryotic Cell. 10, 832-841 (2011).
- Cuomo, C., Güldener, U., Xu, J. R., Trail, F., Turgeon, B. G. The Fusarium graminearum genome reveals a link between localized polymorphism and pathogen specialization. Science. 317, 1400-1402 (2007).
- Desjardins, A. E., Brown, D. W., Yun, S. -H., Proctor, R. H., Lee, T., Plattner, R. D., Lu, S. -W., Turgeon, B. G. Deletion and complementation of the mating type (MAT) locus of the wheat head blight pathogen Gibberella zeae. Applied and Environmental Microbiology. 70, 2437-2444 (2004).
- Gueldener, U., Seong, K. -Y., Boddu, J., Cho, S., Trail, F., Xu, J. -R., Adam, G., Mewes, H. -W., Muehlbauer, G. J., Kistler, H. C. Development of a Fusarium graminearum Affymetrix GeneChip For profiling fungal gene expression in vitro and in planta. Fungal Genetics and Biology. 43, 316-325 (2006).
- Hallen, H., Trail, F. The L-Type calcium ion channel Cch1 affects ascospore discharge and mycelial growth in the filamentous fungus Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum). Eukaryotic Cell. 7, 415-424 (2008).
- Hallen, H., Huebner, M., Shiu, S. -H., Guldener, U., Trail, F. Gene expression shifts during perithecium development in Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum), with particular emphasis on ion transport proteins. Fungal Genetics and Biology. 44, 1146-1156 (2007).
- Lee, J., Lee, T., Lee, Y. -W., Yun, S. -H., Turgeon, B. G. Shifting fungal reproductive mode by manipulation of mating type genes: obligatory heterothallism of Gibberella zeae. Molecular Microbiology. 50, 145-152 (2003).
- Klittich, C. J. R., Leslie, J. F. Nitrate reduction mutants of Fusarium moniliforme (Gibberella fujikuoi. Genetics. 118, 417-423 (1988).
- Min, K., Lee, J., Kim, J. -C., Kim, S. G., Kim, Y. H., Vogel, S., Trail, F., Lee, Y. -W. A novel gene, ROA, is required for proper morphogenesis and discharge of ascospores in Gibberella zeae. Eukaryotic Cell. 9, 1495-1503 (2010).
- Qi, W., Kwon, C., Trail, F. Microarray analysis of transcript accumulation during perithecium development in Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum). Molecular Genetics and Genomics. , 276-287 (2006).
- Trail, F. Fungal cannons: explosive spore discharge in the Ascomycota. FEMS Microbiol. Lett. 276, 12-18 (2007).
- Trail, F., Common, R. Perithecial development by Gibberella zeae: a light microscopy study. Mycologia. 92, 130-138 (2000).
- Trail, F., Xu, H., Loranger, R., Gadoury, D. Physiological and environmental aspects of ascospore discharge in Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum. Mycologica. 94, 181-189 (2002).
Перепечатки и разрешения
