Мониторинг изменений в внутриклеточной концентрации кальция и синаптической эффективности в Моллюск Aplysia

Summary

Мы демонстрируем, как изменения во внутриклеточной концентрации свободного кальция и синаптической эффективности могут быть одновременно контролировать в ганглии подготовки Aplysia. Мы изображений внутриклеточного кальция с помощью флуоресцентного красителя, кальций Orange, и вызывать и контролировать синаптической передачи с острыми (внутриклеточные) электроды.

Abstract

Было высказано предположение, что изменения внутриклеточного кальция опосредуют индукцию ряда важных форм синаптической пластичности (например, гомосинаптическое облегчение) ¹. Эти гипотезы могут быть проверены путем одновременного мониторинга изменений внутриклеточного кальция и изменений в синаптической эффективности. Мы демонстрируем, как этого можно достичь, сочетая кальциевую визуализацию с методами внутриклеточной записи. Наши эксперименты проводятся на буккальном ганглии моллюска Aplysia californica. Этот препарат имеет ряд экспериментально выгодных особенностей: ганглии могут быть легко удалены из аплизии, а в экспериментах используются взрослые нейроны, которые создают нормальные синаптические связи и имеют нормальное распределение ионных каналов. Благодаря низкой скорости метаболизма животного и относительно низким температурам (14-16 °C), которые являются естественными для Aplysia, препараты стабильны в течение длительных периодов времени.

Для обнаружения изменений внутриклеточного свободного кальция мы будем использовать непроницаемую для клеток версию Calcium Orange ², которая легко "загружается" в нейрон с помощью ионофореза. Когда этот длинноволновый флуоресцентный краситель связывается с кальцием, интенсивность флуоресценции увеличивается. Кальций оранжевый обладает быстрыми кинетическими свойствами ³ и, в отличие от ратиометрических красителей (например, Fura 2), не требует фильтрующего колеса для визуализации. Он достаточно фотостабилен и менее фототоксичен, чем другие красители (например, флуоресцентный-3) ^2,4. Как и все нератиометрические красители, Кальций Оранжевый указывает на относительные изменения концентрации кальция. Но, поскольку невозможно учесть изменения концентрации красителя из-за нагрузки и диффузии, он не может быть откалиброван для получения абсолютных концентраций кальция.

Вертикальный сложный микроскоп с неподвижным столиком использовался для изображения нейронов с помощью ПЗС-камеры, способной записывать около 30 кадров в секунду. У Aplysia это временное разрешение более чем адекватно для обнаружения даже одного вызванного спайком изменения внутриклеточной концентрации кальция. Острые электроды одновременно используются для индукции и регистрации синаптической передачи в идентифицированных пре- и постсинаптических нейронах. По завершении каждого испытания пользовательский сценарий объединяет данные электрофизиологии и визуализации. Для обеспечения правильной синхронизации мы используем световой импульс от светодиода, установленного в порту камеры микроскопа. Манипулирование пресинаптическими уровнями кальция (например, с помощью внутриклеточной инъекции EGTA) позволяет нам проверить конкретные гипотезы о роли внутриклеточного кальция в опосредовании различных форм пластичности.

Protocol

1. Подготовка

1. Анестезию животного путем введения 75-100 мл изотонический раствор хлорида магния. Aplysia мы используем для работы с изображениями, как правило, 150-200 граммов и получаются из Маринус Scientific.
2. Pin наркозом животным воском покрыты блюдо. Шприц иглы хорошо работать для этой цели; стерильные методы не являются необходимыми. Использование валового щипцы и ножницы стандартного сделать разрез в ноге животного и подвергать щечной массы. Найдите щечной ганглия. Использование весной ножницами и щипцами штрафа, тщательно бесплатно ганглий, сокращая все щечные нервы.
3. Снимите ганглии и поместить его в Sylgard покрытием б....

Discussion

Мы продемонстрируем методы, которые могут быть использованы для одновременного контроля внутриклеточной концентрации кальция и оценить эффективность синаптической передачи. Эти методы полезны для определения того, как различные формы краткосрочного пластичности опосредовано.

Изображения осуществляется с флуоресцентным микроскопом и ПЗС-камеры. Эти требования к оборудованию являются относительно скромными по сравнению с большинством функциональной визуализации наборов. Техника проста и легка .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Реагент Имя	Компания	Номер по каталогу	Комментировать
Кальций Оранжевый	Invitrogen	C-3013
EGTA	Сигма	E-4378
Кальций калибровки буфера комплект	Invitrogen	C-3008MP	полезно для тестирования чувствительность и динамический диапазон сигнала
Гексагидрат Хлорид магния	Сигма	M0250	использовать в 0,33 М раствора, чтобы обезболить животных

Название оборудования	Компания	Комментировать
FN-1 вертикально флуоресцентного микроскопа	Nikon Instruments	с Narishige ITS-FN1 этапе
NMN-21 манипуляторы	Narishige	установлен на сцене с магнитами
CoolSNAP HQ 2 CCD камеры	Фотометрия
NIS элементов AR (Версия 3.22)	Nikon Instruments	изображений программное обеспечение используется для получения данных флуоресценции
10X/0.3w Plan Fluor цели	Nikon Instruments	этот объектив погружения в воду имеет очень большое рабочее расстояние 3,5 мм
X-Cite 120 PC металлогалогенные лампы	EXFO	используется для флуоресцентной микроскопии
LS-DWL галогенные лампы	Sumica
ET-CY3 набор фильтров	Chroma технологии	;
Мощность 1401 A / D конвертер	Cambridge Electronic Design	выборка была сделана на 3 кГц
Спайк II (Версия 7.07)	Cambridge Electronic Design	Программное обеспечение используется для получения данных электрофизиологии
SEC-10 LX усилителем	НПИ электроники	использовать с 10-кратным headstage
Модель 410 Усилитель	Браунли точности	используется для усиления и фильтрации сигнала
WS-4	минус к технологиям	виброизоляции для работы с изображениями
охлаждение платформы	заказ	латунные пластины, через которые ледяную воду закачивают с переменной скоростью