Методическая статья

Electroantennographic биопроб в качестве скринингового инструмента для летучих растения-хозяина

13.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/3931

⸱

6 мая 2012 г.

 ,  , 
1Plant Mycotoxin Research, U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Service

В этой статье

Краткое содержание

Метод быстро экран летучие растения-хозяина путем измерения электрофизиологических ответ взрослого orangeworm пупка ( Amyelois transitella) Антенны на отдельные компоненты и смеси через electroantennographic анализ показал.

Аннотация

Летучие вещества растений играют важную роль во взаимодействиях между растениями и насекомыми. Насекомые-фитофаги используют летучие вещества растений, известные как кайромоны, для поиска своего растения-хозяина.1,2 Когда растением-хозяином является важная сельскохозяйственная культура, повреждения от питания насекомых-вредителей могут нанести серьезный экономический ущерб производителям. Соответственно, кайромоны могут использоваться в качестве аттрактантов для приманивания или дезориентации этих насекомых и, таким образом, предлагать экологически безопасную альтернативу пестицидам для борьбы с насекомыми.3 К сожалению, растения могут выделять огромное количество летучих веществ с различным составом и соотношением эмиссий в зависимости от фенологии культуры или времени суток. Это делает процесс идентификации биологически активных компонентов или смесей летучих компонентов трудоемким. Чтобы помочь в идентификации биоактивных компонентов летучих эмиссий растений-хозяев, мы применяем лабораторный скрининговый биоанализ — электроантеннографию (ЭАГ). ЭАГ является эффективным инструментом для оценки и электрофизиологической регистрации обонятельных реакций насекомого через рецепторы их антенн. Процесс скрининга с помощью ЭАГ может помочь сократить количество тестируемых летучих веществ для выявления перспективных биоактивных компонентов. Однако биоанализы ЭАГ предоставляют информацию только об активации рецепторов. Они не дают информации о типе поведения насекомого, который вызывает соединение; оно может действовать как аттрактант, репеллент или вызывать другой тип поведенческой реакции. Летучие вещества, вызывающие значительный ответ при ЭАГ по сравнению с соответствующим положительным контролем, обычно направляются на дальнейшее тестирование поведенческих реакций насекомого-вредителя. Представленный план эксперимента детально описывает методологию, используемую для скрининга летучих веществ растений-хозяев на основе миндаля4,5 путем измерения электрофизиологических антенных ответов взрослого насекомого-вредителя, навельной огневки (Amyelois transitella), на отдельные компоненты и простые смеси компонентов с помощью биоанализа ЭАГ. Метод предполагает использование двух иссеченных антенн, помещенных в вилочный держатель электродов. Протокол, продемонстрированный здесь, представляет собой быстрый, высокопроизводительный стандартизированный метод скрининга летучих веществ. Каждое летучее вещество вводится в установленном постоянном количестве для стандартизации уровня стимула, что позволяет антенным ответам служить показателем относительной хеморецептивности. Отрицательный контроль помогает исключить электрофизиологический ответ как на остаточный растворитель, так и на механическое воздействие струи воздуха. Положительный контроль (в данном случае ацетофенон) представляет собой одно соединение, которое вызывает стабильный ответ у самцов и самок моли навельной огневки (NOW). Дополнительный стандарт семиохимического вещества, который обеспечивает стабильный ответ и используется для биоаналитических исследований с самцами моли NOW, — это (Z,Z)-11,13-гексадекадиеналь, альдегидный компонент полового феромона, вырабатываемого самками.6-8

Протокол

1. Подготовка Летучие обнаружен с растением-хозяином для скрининга ЕАГ

  1. После соответствующей идентификации и аутентификации всех летучих веществ с помощью GC-MS, выполнить ЕАГ слоеного анализ каждого из доступных нестабильной. Первоначальная проверка может быть небольшое количество повторных усиков ответов (N = 3-5) для каждого пола, чтобы добиться указания относительного chemoreceptivity в короткий промежуток времени (табл. 1).
  2. Приготовьте раствор каждого летучего на 5 мг / мл, концентрация пентана. Плотно запечатать и поставить в холодильник образца до готовности к немедленному использованию (например, ацетофенон, плотность = 1,03 г / мл, объем = (0,005 g/1.03 г / мл) х 1000 = 4,85 мкл ацетофенона в колбу 1,0 мл объемный и развести на 1,0 мл с пентана).
  3. Незадолго до ЕАГ анализ, удалить флаконах, содержащих по 5 мг / мл, концентрация летучих быть проверены и позволяют нагреться до комнатной температуры. Между тем, маркировать нужное количество пипетки Пастера вкоррелируют друг с летучими быть проверены, и завернуть кусочек парафильмом (около 15 × 15 мм) на кончике пипетки. Для первоначальной проверки 10 пипетки стимул (N = 4 для каждого мужчины и женщины) будут загружены в случае плохой подготовительной или других непредвиденных препятствий.
  4. С помощью пинцета аккуратно сложить биопроб диска в два раза для облегчения размещения в пипетку, а затем частично поместите сложенную диск в большой конец пипетки, так что ок. 2-3 мм диска подвергаются. Совместите маркировку и нацелен пипетки в стойку держателя.
  5. С помощью пипетки или шприца, нагрузка 10 мкл (50 мкг) летучих решение на каждом диске и позволяет 2 минуты, чтобы пройти, прежде чем полностью вставки диска в пипетку. После загрузки сразу запечатать конец пипетки с парафильмом (около 15 × 30 мм). Количество летучих стимул должен быть загружен и пыхтел, скорее всего, меняться в зависимости от вида насекомых.
  6. Следуя той же протокол отмечалось выше подготовить элементы управлениявключать в каждый анализ. Для отрицательного контроля нагрузки 10 мкл только пентан на каждый диск, подождать 2 минуты, загрузить в пипетка помечены, и печатью. Для положительного контроля, нагрузка 10 мкл (50 мкг) на диск, подождать 2 минуты, нагрузка на меченые пипетки, а печать с парафильмом.
  7. Жизнеспособность насекомых усиков приготовительный, скорее всего, меняться в зависимости от вида, но мы обнаружили, что Amyelois transitella антенны обычно остаются активными и последовательными в течение> 30 минут после удаления использованием описанного протокола. Это время обычно позволяют до 4-10 летучих образцов для оценки. В таблице 2 приведен пример раза и последовательности.

2. Подготовка насекомых Антенны для ЕАГ биопроб

  1. В центре внимания этого эксперимента ЕАГ анализ, таким образом, предположение о том, что каждый исследователь будет иметь доступ к надлежащим воспитал насекомых.
  2. Для этого эксперимента мы будем изучать 3-4 дня олг, вязка мужского и женского моли. Индивидуальные моли переданы в небольшой крышкой, пластиковый контейнер в день анализа. Непосредственно перед биопроб, моли быть проверены передается головой в проведении аппарата (например, из различных пластиковыми наконечниками пипетки) и обеспеченные сзади. Манипуляции с насекомыми можно рассматривать под маломощным стерео микроскоп для облегчения удаления.
  3. Антенны дразнят с использованием проволоки наконечником инструмента. Вилка держатель, с небольшой фильм электродов гелем, находится в непосредственной близости для быстрой передачи антенны. Первая антенна вырезали ножницами с использованием микро и размещены на вилку, обеспечение основании антенны находится на не-красной части вилки (индифферентный электрод заземления). Таймер набор на 10 минут запущен и второй антенны вырезали и помещали рядом с первой антенны с обеих баз на той же стороне вилки.
  4. Кроме того, антенна может быть оставлен в обеспеченных holdinг трубы, вырезают, затем осторожно удалить из между трубой и насекомых с помощью провода наконечником инструмента прикосновение геля на конце.
  5. Антенны проверяются для обеспечения базы и кончик погружаются в гель и электрод не пузырьки находятся в геле. Концы / советы могут быть сокращены, чтобы гарантировать полное воздействие электрода гелем. Следует соблюдать осторожность, чтобы оставшаяся часть каждой антенны не покрыты гелем, таким образом гарантируя максимальную усиков поверхность подвергается затянуться.
  6. Нацелен вилкой затем вставляется зонд предварительного усилителя и находится под постоянным потоком увлажненного воздуха в 200 мл / мин в течение оставшегося времени в 10 минут ожидания. Акцизный времени и ЕАГ начала времен отмечалось (табл. 2) и 30 секунд до первой затяжки стимул, пипетки, содержащий положительную управления распечатаны и размещены в держателе, который регулируется, чтобы направить воздух / слоеного поток 2-3 мм от Антенны нацелен.
  7. После каждого экспериментаiment, тест моли эвтаназии в сухом месте лед и правильно утилизировать.
  8. Женский моли расчлененный проверить брачного статуса. Сожителем, мужчины, как предполагается, что вязка.

3. ЕАГ протокола для отдельных компонентов

  1. Усиков ответы записываются через AutoSpike программного обеспечения, входящего в прибор ЕАГ Syntech. Конфигурация на вкладке Свойства AutoSpike для канала с зондом ЕАГ установлен на частоту дискретизации 106,7, NO исправить, и фильтр 0-42 Гц. Для вкладку Фильтр, фильтр ЕАГ включена и низкого среза установлен 0,1 Гц.
  2. Стимул клубы 1-2 секунд. Таймер установлен для 1 минуты начинается после каждой затяжке.
  3. Следующий тест летучих пипетки распечатаны и размещены в держатель. Последовательность испытаний летучих веществ, рандомизированных между работает чтобы убедиться в отсутствии исследуемых соединений последовательно следуют один тест летучих, затем следует (например, таблица 2) тщательно allowiнг 1 минуты между затяжками.
  4. Для упрощения чтения ЕАГ ответы, часть правителей размещаются на экране компьютера и базового уровня до вершины вниз сигнал отклонения измеряется в мм и вошел в лист данных (например, для настройки 5 мВ, 33 мм = 2,5 мВ). Программное обеспечение имеет возможность воспроизведения сохраненных записей для последующего анализа. Преобразование мм или мВ или мкВ амплитудой осуществляется в последующего анализа данных.
  5. После окончательного положительного слоеного управления (например, запись № 12) находится в ведении, антенны будут удалены, вилки очищается этанола насыщенных вытереть и дать высохнуть до последующего использования.
  6. Для увеличения пропускной способности тестов, удаление следующий набор антенн может быть запущен второй лаборатории, примерно за 10 минут до конца текущего эксперимента - после четвертого слоеное, второй тест летучих текущего эксперимента, согласно таблицы 2. Это позволит лг начала следующего эксперимента сразу после завершения текущего эксперимента.
  7. Большее число повторений (на разных антенн) могут быть выполнены на соединениях интерес предоставить дополнительную статистическую проверку.

4. Пример ЕАГ Анализ смеси или другие матрицы (табл. 3)

  1. Далее, соотношения и объемы двух третичных смеси (3-смесей) рассчитываются привести пример объединения летучих вызывая высокий ответы ЕАГ (табл. 4). Расчеты за основные коэффициенты, 1:01:01 молярное соотношение α-humulene: 2-undecanone: 2-фенилэтанола и по сравнению с вторым соотношение смесь 1:02:04.
  2. Используя аналогичные протоколы, описанные выше, смеси готовы и маркированы Пастера Пипетки загружаются вместе с необходимыми положительный и отрицательный контроль.
  3. Летучих образцов пыхтел по мужской и женской антенн и ответы измеряются и регистрируются нана лист данных (табл. 3).

5. Представитель Результаты

Для женщин orangeworm пупка Следующие параметры используются: 2 секунды затяжек, 10 секунд записи, 10-секундный окна, и 5 мВ масштабе. Отрицательное отклонение является типичным ответом, но абсолютное значение фиксируется (например, -3400 мкВ отклонение регистрируется как 3400 мкВ). Относительно слабая реакция на подготовительной к положительному контролю отбрасывается. На рисунке 1 представлена ​​графическим представлением плохой ответ на положительный контроль пупка orangeworm.

Например, в результате плохой контроль, средняя женщина усиков ответ на ацетофенон, как правило, ок. 2600 мкВ (рис. 2), если подготовительные только дал ответ ок. 1300 мкВ он будет отброшен, а другая пара антенн нацелен. Кроме того, средний мужской ответ на (Z, Z) -11,13-hexadecadienal был typicallу 3000 мкВ, таким образом, любой ответ менее 1500 мкВ был обычно отбрасываются.

Положительный контроль в начале и конце каждого эксперимента также предоставляет информацию о состоянии антенны. Правило следовать для быстрого скрининга, если усиков ответ на слоеном пост-контроль (отчет № 12, таблица 2) либо менее 75% от 1-го слоеного предварительного контроля (запись № 1 , таблица 2) или меньше, чем 2-й слоеного предварительного контроля (запись № 2, таблица 2), то эксперимент не используется в анализе данных из-за возможного ухудшения приготовительный (рис. 3). Примером первого правило будет запись # 1 = 2730 мкВ и запись # 12 = 1680 мкВ, а второе правило: если запись # 2 = 2350 мкВ и запись # 12 = 1680 мкВ, в каждом из этих случаев , подготовительные и эксперимента результаты будут отброшены.

типичный пример исправления ЕАГ значений ответ, как измеряется с положительным контролем будет выглядеть следующим образом.

Запустите # ЕАГ (мкВ) Запуск № 2 ЕАГ (мкВ) Запуск № 3 ЕАГ (мкВ)
(+) Ctrl 2800 (+) Ctrl 2420 (+) Ctrl 3030
Cmpnd 3000 Cmpnd 2500 Cmpnd 3440
(-) Ctrl 530 (-) Ctrl 755 (-) Ctrl 910
Cmpnd B 2400 Cmpnd B 2000 Cmpnd B 2560
(+) Ctrl 2770 (+) Ctrl 2400 (+) Ctrл 3020

Используя значения выше для N = 3 эксперимент, отрицательный ответ контроль вычитается из всех значений в каждом эксперименте при условии отрицательного контроля является базовой антенны ответ на механическое слоеного и остаточного растворителя.

Запуск № 1 ЕАГ (мкВ) Запуск № 2 ЕАГ (мкВ) Запуск № 3 ЕАГ (мкВ)
(+) Ctrl 2270 (+) Ctrl 1665 (+) Ctrl 2120
Cmpnd 2470 Cmpnd 1745 Cmpnd 2530
(-) Ctrl 0 (-) Ctrl 0 (-) Ctrl 0
Cmpnd B 1870 Cmpnd B 1245 Cmpnd B 1650
(+) Ctrl 2240 (+) Ctrl 1645 (+) Ctrl 2110

Положительного контроля для каждого эксперимента будут затем усредняются и исправлены до 1000 мкВ, отметив, что коэффициент для коррекции до 1000 мкВ. Лист данных (например, Excel) можно легко манипулировать для преобразования ответов на полезные данные.

Запуск № 1 Средняя (мкВ) Запуск № 2 Средняя (мкВ) Запуск № 3 Средняя (мкВ)
(+) Ctrl 2255 (+) Ctrl 1655 (+) Ctrl 2115
(+) Ctrl прил. 1000 (0.443) (+) Ctrl прил. 1000 (0.604) (+) Ctrl прил. 1000 (0.473)

Умножая на поправочный коэффициент в каждом эксперименте значения для соединения и соединения B корректируется.

Запуск № 1 Adj. ЕАГ (мкВ) Запуск № 2 Adj. ЕАГ (мкВ) Запуск № 3 Adj. ЕАГ (мкВ)
Cmpnd 1094 Cmpnd 1054 Cmpnd 1197
Cmpnd B 828 Cmpnd B 752 Cmpnd B 780

Средние (средств) для каждого соединения, затем определяется наряду с другими соответствующими статистическими данными и ЕАГ ответы соединений испытания могут быть оцененыкандидатуры для дальнейшего расследования.

Соединение ЕАГ (мкВ) Нет. Работает, N =
1115 3
B 787 3

figure-protocol-1
Рисунок 1. Представитель ЕАГ для мужчин усиков ответ (1180 мкВ) для предварительного управления (1-й положительный слоеного контроля), которые будут отброшены из-за плохого усиков ответ после обеспечения антенны имеют хороший контакт с гелем. Синий бар в нижней окна представляют собой два вторых слоеного летучих. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

figure-protocol-2
Чонг> Рисунок 2. представитель ЕАГ для женских усиков ответ (3400 мкВ) на 1-й слоеного предварительного управления, которое будет сочтено необходимым. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

figure-protocol-3
Рисунок 3. Представитель ЕАГ для женских усиков ответ (1680 мкВ) на пост-контроль (последний положительный контроль для каждого эксперимента), которые будут рассматриваться бедных, и указывающие на ухудшение антенны (<75% от 1-го предварительного управления или < 2-й слоеного значение предварительного контроля). В данном примере 1-го предварительного управления слоеного был 2730 мкВ и 2-го предварительного управления слоеного был 2350 мкВ. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

dflinebreak "> figure-protocol-4
Рисунок 4. Представитель ЕАГ для женских усиков ответ (3800 мкВ) в слоеном кандидата летучие смеси и последующего измерения максимального начального отклонения (3800 мкВ), начальный наклон в слоеном продолжительность (0,3 мВ = s/1.2 0,25 сек / мВ), а наклон течение всего оставшегося времени слоеного (1.6 мВ s/1.9 = 0,84 с / мВ). Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

figure-protocol-5
Рисунок 5. Малый изменение сосуд матрицы образца и связанные с летучими быть пыхтел через А. transitella антенны.

ad/3931/3931table1.jpg "/>
Таблица 1. В месте летучих выбросов несравненный миндаль (2007) и ЕАГ ответов определяется другой, менее чувствительны конфигурации в Autospike программы.

figure-protocol-6
Таблица 2. Пример формы для записи мужских и женских усиков ответы на отдельные летучие компоненты.

figure-protocol-7
Таблица 3. Пример формы для записи мужских и женских усиков ответы на летучие смеси и / или букеты.

figure-protocol-8
Таблица 4. Примеры подготовки 10 мл 5 мг / мл раствора для двух различных соотношениях смеси.

figure-protocol-9
Таблица 5. Пример формы для записи двух последовательных затяжек одного летучих компонентов между мужским и женским антенны.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Использование electroantennogram записи как биопробы, чтобы определить хеморецепции ответы целевой насекомых является довольно распространенным и многочисленных исследований с использованием ЕАГ в качестве детектора для стоков из газовой хроматограмме (GC-EAD) можно найти в литературе. 9,10 метод показал обеспечит быстрое обследование эквивалентных количеств летучих компонентов с высокой репликаций для уверенного назначения относительно реагирования. AutoSpike программы в программу Syntech это хорошая програм...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Автор существующих совместных исследований и развития соглашение с Paramount Сельское хозяйство компании, компании, имеющие связи с Suterra LLC.

Благодарности

Данное исследование было проведено при USDA-ARS КРИС проекта 5325-42000-037-00D и с результатами CRADA 58-3K95-7-1198 и TFCA 58-5325-8-419. Авторы выражают благодарность Suterra за дар (Z, Z) -11,13-hexadecadienal, Б. Хигби для продуктивного обсуждения и Дж. Бейкер по оказанию технической помощи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Название реагента Компания Номер по каталогу Комментарии
Ацетофенона Альфа-Aesar A12727 Женский положительный контроль
(Z, Z) -11,13-Hexadecadienal Suterra Мужской положительный контроль
α-Humulene Aldrich 53675 Сесквитерпеновые
2-Undecanone Aldrich U1303 Жирные кислоты, производные
2-фенилэтанола Aldrich 77861 Бензеноидных
Пентан EMD PX0167-1 Растворитель
4-канальный контроллер приобретение Syntech ЯDAC-4
ЕАГ зонд, предварительного усилителя Syntech Тип PRG-2
Антенна держатель Syntech Для PRG-2 Вилка электрод
Стимул контроллер Syntech CS-55 Расход воздуха и клубы
Гель спектры электродов Паркер 12-02
Биопроб дисков Ватман 2017-006 6 мм
Пастера пипец VWR 14673-010 5 ¾ "(14,6 см)
Парафильмом M Bemis PM-992

Ссылки

  1. Bruce, T. J. A., Wadhams, L. J., Woodcock, C. M. Insect host location: a volatile situation. Trends in Plant Sci. 10, 1360-1385 (2005).
  2. Unsicker, S. B., Kunert, G., Gershenzon, J. Protective perfumes: the role of vegetative volatiles in plant defense against herbivores. Curr. Opin. Plant Biol. 12, 479-485 (2009).
  3. Norin, T. Semiochemicals for insect pest management. Pure Appl. Chem. 79, 2129-2136 (2007).
  4. Beck, J. J., Merrill, G. B., Higbee, B. S., Light, D. M., Gee, W. S. In situ seasonal study of the volatile production of almonds (Prunus dulcis) var. 'nonpareil' and relationship to navel orangeworm. J. Agric. Food Chem. 57, 3749-3753 (2009).
  5. Beck, J. J., Higbee, B. S., Gee, W. S., Dragull, K. Ambient orchard volatiles from California almonds. Phytochem. Lett. 4, 199-202 (2011).
  6. Coffelt, J. A., Vick, K. W., Sonnet, P. E., Doolittle, R. E. Isolation identification, and synthesis of a female sex pheromone of the navel orangeworm, Amyelois transitella (Lepidoptera: Pyralidae). J. Chem. Ecol. 5, 955-933 (1979).
  7. Leal, W. S., Parra-Pedrazzoli, A. L., Kaissling, K. -E., Morgan, T. I., Zalom, F. G., Pesak, D. J., Dundulis, E. A., Burks, C. S., Higbee, B. S. Unusual pheromone chemistry in the navel orangeworm: novel sex attractants and a behavioral antagonist. Naturwissenschaften. 92, 139-146 (2005).
  8. Kanno, H., Kuenen, L. P. S., Klingler, K. A., Millar, J. G., Carde, R. T. Attractiveness of a four-component pheromone blend to male navel orangeworm moths. J. Chem. Ecol. 36, 584-591 (2010).
  9. Takacs, S., Gries, G., Gries, R. Semiochemical-mediated location of host habitat by Apanteles carpatus (Say) (Hymenoptera: Braconidae), a parasitoid of cloths moth larvae. J. Chem. Ecol. 23, 459-472 (1997).
  10. Karimifar, N., Gries, R., Khaskin, G., Gries, G. General food semiochemicals attract omnivorous German cockroaches, Blattella germanica. J. Agric. Food Chem. 59, 1330-1337 (2011).
  11. Molyneux, R. J., Schieberle, P. Compound identification: a Journal of Agricultural and Food Chemistry perspective. J. Agric. Food Chem. 55, 4625-4629 (2007).
  12. Marion-Poll, F., Thiery, D. Dynamics of EAG responses to host-plant volatiles delivered by a gas chromatograph. Entomol. Exp. Appl. 80, 120-123 (1996).
  13. Beck, J. J., Higbee, B. S., Merrill, G. B., Roitman, J. N. Comparison of volatile emissions from undamaged and mechanically damaged almonds. J. Sci. Food Agric. 88, 1363-1368 (2008).
  14. Lucas, P., Renou, M., Tellier, F., Hammoud, A., Audemard, H., Descoins, C. Electrophysiology and field activity of halogenated analogs of (E,E)-8-10-dodecadien-1-ol, the main pheromone component in codling moth (Cydia pomonella L.). J. Chem. Ecol. 20, 489-503 (1994).
  15. Rodriguez-Saona, C., Poland, T. M., Miller, J. R., Stelinski, L. L., Grant, G. G., de Groot, P., Buchan, L., MacDonald, L. Behavioral and electrophysiological responses of the emerald ash borer, Agrilus planipennis, to induced volatiles of Manchurian ash, Fraxinus mandshurica. Chemoecology. 16, 75-86 (2006).
  16. Burks, C. S., Brandl, D. G. Seasonal abundance of navel orangeworm (Leipidoptera: Pyralidae) in figs and effect of peripheral aerosol dispensers on sexual communication. J. Insect Sci. 4, 1-8 (2004).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи