Выделение иммунных клеток из первичной опухоли

Краткое содержание

В этом докладе мы описываем протокол выделения высокоочищенного популяции лейкоцитов, которые проникают опухолей. Этот протокол адаптирован из Miltenyi Biotech протокол для повышения урожайности и чистота выделения клеток из сложной ткани опухоли.

Аннотация

Опухоли создают уникальную микросреду иммуносупрессивных (опухоль микросреде, TME), в котором лейкоциты привлекаются в опухоли различных хемокинов и ^1,2 факторов роста. Однако, как только в TME, эти клетки теряют способность содействовать противоопухолевого иммунитета и начать поддерживать рост опухоли и вниз регулировать противоопухолевых иммунных реакций ^3-4. Исследования опухолеассоциированным лейкоцитов в основном фокусировались на клетки, выделенные из опухоли дренаж лимфатических узлов или селезенки из-за неизбежных трудностей в получении достаточного количества клеток и чистоты от первичной опухоли. При определении механизмов активации клеток и торговли через лимфатическую систему в опухоли мышей, несущих важно и может дать представление на кинетику иммунный ответ на рак, по нашему опыту, многие лейкоцитов, в том числе дендритные клетки (ДК), в опухоли слива лимфатические узлы имеют различный фенотип, чем те, которые проникают опухолей ^5,6. Кроме того, мы уже показали, что восприимчиво-передаются Т-клетки, выделенные из опухоли лимфатических узлов слива не tolerized и способны реагировать на вторичном стимуляции в пробирке в отличие от Т-клеток изолирован от TME, которые tolerized и неспособной распространения или цитокинов Производство ^7,8. Интересно, что мы показали, что изменение микроокружения опухоли, таких как обеспечение клеток CD4 ⁺ Т-хелперов через приемные передачи, способствует CD8 ⁺ Т-клеток для поддержания провоспалительных эффекторные функции ^5. Результаты каждого из упомянутых выше исследований показывают важность измерения клеточных реакций от TME-проникновение иммунных клеток, в отличие от клеток, которые остаются на периферии. Для изучения функции иммунных клеток, которые проникают опухолей с использованием изоляции Miltenyi Biotech системы ^9, мы изменили и оптимизировать это антитело изоляции на основе процедуры получения высокой электроннойnriched населения антиген представляющих клеток и опухолевый антиген-специфических цитотоксических Т-лимфоцитов. Протокол включает в себя подробное вскрытие мышей ткани простаты из спонтанных модель опухоли простаты (трансгенных Аденокарцинома предстательной железы мыши-TRAMP) ¹⁰ и меланомой подкожно (B16) модели опухоли с последующей очистки различных лейкоцитов населения.

Протокол

1. Выделение миелоидных клеток из опухоли простаты TRAMP

1. Все процедуры проводились под руководством комиссии по рассмотрению животных. TRAMP мыши спонтанно развиваются опухоли простаты автохтонных в результате трансгена (SV40) контролируется промоутер probasin ^10. Любой мужчина мышь можно использовать для этой процедуры. Хотя TRAMP опухоли могут быть собраны в любом возрасте, следует отметить, что TRAMP опухолей предстательной железы обычно остаются небольшими до мышей достигает возраста более 20 недель. Усыпить мышей CO ₂ удушья. Удалить урогенитального тракта (УГТ), за счет сокращения открытой брюшной полости и отходили жировой ткани. Жировая ткань является пенистый, блестящий искать ткани.
2. Найдите в мочевой пузырь, она находится прямо между двумя большими, белыми семенных пузырьков. Держитесь мочевого пузыря пинцетом. Ведение ножницы закрыты, сгладить жировой ткани и найдите уретры. Сократите уrethra как можно ближе к тазового пояса, как можно и разъединить семявыносящих протоков. В то время как сокращение, одновременно потянуть на мочевой пузырь. Это освободит весь UGT, которые теперь могут быть микро-расчлененных получить каждую из долей железы.
3. Поместите UGT при комнатной температуре PBS. Используйте рассечения микроскоп для визуализации UGT и убрать излишки жировой ткани. Используя щипцы, держать на уретру и собирать брюшной, боковой и передней доли предстательной железы. Поместите ткань в ФСБ в то время как вы собираете остальных долей.
4. Удаление семенных пузырьков и выбросить.
5. Включите оставшиеся ткани 180 °. Соберите ampullary железы и спинной доли предстательной железы.
6. Используя щипцы, дразнить, кроме ткани простаты и поместить его в пищеварении (диссоциации) буфера.
7. Место опухолевой ткани в 1 мл буфера диссоциации (100 ЕД / мл коллагеназы IV типа и 100 мкг / мл ДНКазы в RPMI + 10% FBS). Каждая опухоль может requГнев уникальные условия диссоциации, для TRAMP опухолей предстательной железы, используя 1 мл и B16 опухоли, используют 5 мл (см. ниже). Обратите внимание: степень коллагеназы (I-IV) будет зависеть от клеточной популяции, чтобы быть изолированными; миелоидной изоляторе лучше типа IV, в то время как лимфоциты урожай выше при использовании типа I.
8. Место трубы в 37 ° C инкубатор на 30 мин.
9. Пипетировать вверх и вниз с 1 мл пипетки, чтобы получить легко течет суспензии отдельных клеток.
10. Фильтры суспензии через 70 микрон фильтр и промыть 3 раза с ПДК разделения буфера с добавлением 10% FBS в изоляторе миелоидной.
11. Центрифуга клеточной суспензии в 400 мкг в течение 10 мин. Затем смыть осадок с 10 мл буфера ПДК и центрифуги снова с теми же настройками.
12. Ресуспендируют клеточный осадок в 100 мкл буфера ПДК. Затем добавьте 1 мкг anti-CD16/32 антител (АТ) в 10 ⁸ клеток (200 мкл 2.4.G2 культура супернатанта гибридомы) и выдержите при комнатной температуре в течение 10 мин. Примечание: тОн сумму FCR-γ блокирование антитела (АТ), которые будут добавлены может варьироваться в зависимости от частоты / количество FCR-γ ⁺ клеток в ткани и объем клеточной суспензии, поэтому этот шаг может потребовать оптимизации.
13. Добавить 100 мкл "Пан-DC" или 10 мкл анти-CD11b, анти-CD11c или анти-PDCA-1 микрошариков на 10 всего ⁸ ячеек, в зависимости от требуемой клеточной популяции. Примечание: сумма микрошарики необходимости может меняться в зависимости от частоты / количество клеток желаемого населения в тканях, поэтому этот шаг может потребовать оптимизации.
14. Хорошо перемешайте, аккуратно стряхивая трубка (Не Vortex) и инкубировать в течение 15 мин при температуре 4-8 ° C, защищены от света. Не инкубировать на льду.
15. Вымойте клеток путем добавления 10 мл буфера ПДК. Центрифуга 400 мкг в течение 10 мин.
16. Слейте надосадочную полностью и ресуспендирования клеток в 500 мкл буфера ПДК. Опухолевые клеточные суспензии поступать лучше через колонки LC. (Прочиевыбор: MS, LS, LD).
17. Применить новую колонку в магнитный сепаратор. Премьер-колонки промывкой соответствующим количеством буфера ПДК для колонки выбраны: для ЖК и MS столбцы используют 500 мкл. Для LS LD или столбцов использовать 1 мл. После грунтовки колонки, применяют клеточную суспензию на вершину колонны. Использование одной колонке для каждого 1 х 10 ⁸ клеток.
18. Соберите немеченого клеток (сквозной) и промойте колонку как минимум три (до пяти) раз с 500 мкл на общую сумму 1,5-2,5 мл жидкости стирки. Выполните мыть шаг 1, добавив ПДК буфера колонки, важно сохранить колонки течет. Как только колонна капает последняя капля, добавить больше буфера. Не позволяйте колонке стенда без течения или позволить ему работать всухую (это не может быть занижена, так как сушка колонка может разрушить чистоту и привести к значительной потере жизнеспособности клеток.). Для мытья шаг 2, промыть колонку смеси диссоциации буфера (содержащего коллагеназы + ДНКазы де-описанные в пункте 1.7), это служит "жесткие" мыть шаг, чтобы избавиться от липких мусора из мертвых или умирающих раковых клеток. Выполните шаг 3 мыть с буфером ПДК, если поток через выглядит не вполне ясно после мытья шаге 3, продолжать мыть в течение 2 дополнительные шаги для умывания с MAC-буфера (в общей сложности 5 промывок). Для больших опухолей подкожной (например, меланома В16), на последнем этапе стирки, применяется мягкое давление с перчатке пальца к верхней части колонки, это высвобождает дополнительные мусора для более чистой, очищенной клеточной популяции. Этот шаг не является обязательным для солидных опухолей, таких как ткани предстательной железы, наоборот, использовать дополнительные шаги, стирка, стирка в общей сложности по крайней мере 5-6 раз.
19. Удалить столбец из магнитного сепаратора и поместите его на подходящую трубу коллекции. Внесите 2 мл буфера на колонку. Соберите магнитно меченых клеток, плотно применения поршень снабжен столбца.
20. Граф номер ячейки и подтвердить чистоту выбранной популяции клеток попроточной цитометрии. Для идентификации населения, округ Колумбия, предложил включить маркеры CD45, CD11c, PDCA-1, B220 и CD11b. Предлагаемые маркеров макрофагов включают CD45, CD11b, F4-80, и Ly6C.

2. Выделение восприимчиво переданных Т-клетки из подкожной опухоли меланомы B16

Этот протокол работает лучше всего с опухолями, которые составляют 250 мм ² или меньше (оценивали по рассекает диаметра опухоли).

1. B16 опухолевые клетки вводили подкожно в C57BL / 6 мышей и опухолей измерения были записаны каждые 2 дня, 8. У мышей с опухолями измерения 250 мм ² эвтаназии СО ₂ удушья. Использование автоклавного хирургические инструменты промывают 70% этанолом, вырезать опухоль на мелкие (<3 мм) кусочки и инкубировать в 5 мл диссоциации раствора (RPMI среду с добавлением 5% FBS, коллагеназы типа I (200 ЕД / мл) и ДНКазы I (100 мкг / мл)) в течение 30 мин при 37 ° C, Пипетирование (с 1000 μл кончик пипетки) и встряхивая каждые 10 минут во время инкубации. Если миелоидных клеток впоследствии будут изолированы, заменить 5% FBS и коллагеназы I типа с 10% FBS и коллагеназы IV типа (200 ЕД / мл) соответственно.
2. После инкубации суспензии клеток проходят через сито 70 мкм клетки и мыть два раза по 10 мл буфера ПДК (подготовлен в соответствии с инструкциями производителя, Miltenyi Biotech). По желанию - для очень больших опухолей (> 300 мм ^2), воспалительные клетки могут быть предварительно обогащенных использованием центрифугирования в градиенте плотности (Перколла или Ficoll).
3. Аспирируйте стирки супернатант и добавить 1 мкг anti-CD16/32 antibody/10 ⁸ клеток (200 мкл клон супернатант культуры 2.4.G2) и выдержите при комнатной температуре в течение 10 мин.
4. Без стирки, добавьте 1 мкг анти-Thy1.1 PE антитела в 10 ⁸ клеток, хорошо перемешать, аккуратно стряхивая трубки и инкубировать в течение 30 минут на льду, защищены от света.
5. Промойте клетки для удаления несвязанных PRIМария антител, добавив 10 мл ПДК буфера и центрифуги 400 мкг в течение 5 минут.
6. Аспирируйте супернатант и добавить 20 мкл анти-PE микрошарики (Miltenyi Biotech) в 10 ⁷ общего числа клеток, в соответствии с инструкциями производителя.
7. Хорошо перемешайте, аккуратно стряхивая трубку (не вихря) и инкубировать при температуре 4 ° C (не используйте лед) в течение 15 минут, защищены от света. Внимание: встряхивая может уменьшить целостности бисера.
8. Вымойте клеток путем добавления 10 мл ПДК буфера и центрифуги 400 мкг в течение 5 минут.
9. Аспирируйте супернатант и ресуспендирования клеток в 500 мкл буфера ПДК. Для опухолей больших размеров (> 300 мм ^2), использовать 1 мл буфера.
10. Поместите один LC (Большой Cell) столбца в поле магнитного сепаратора. Опухолевые клеточные суспензии поступать лучших по этим столбцам. Промойте колонку с 500 мкл буфера ПДК для главного столбца. Большинство опухолей будет проходить через ЛС и LD столбцов, но требуют дальнейшего переваривания и механических гisruption для достижения соответствующего уровня суспензии отдельных клеток. Промойте колонку с 1 мл буфера ПДК для главного столбца.
11. Применение клеточной суспензии на колонку и позволяет полностью проходить через (не давая колонки всухую). Затем промыть 500 мкл буфера ПДК, и повторить мытье 3x. Только добавить новый буфер, когда колонна резервуар пуст, но не позволяйте колонки стоят вне потока. Это приведет к засорению и снижение чистоты.
12. Это очень важный шаг для больших опухолей подкожной: После последнего шага стирки, с кончика пальца в перчатке, применить легкое давление в верхней части колонки в то же время на магнитном сепараторе. Это высвобождает дополнительные мусора для более чисто обогащенный населения. Затем вымыть колонки 1 больше времени с 500 мкл буфера ПДК.
13. Удалить столбец из сепаратора и поместите его в чистый 15 мл конические трубки, добавляют 2 мл ПДК буфера в колонку. Промойте магнитно-меченных челLs с усилием нажимая на поршень в колонну.
14. Центрифуга элюированных доли в 400 мкг в течение 5 мин. Чистота на этом этапе, как правило, между 75-80%. Для достижения> 90% чистоты, повторите процедуру магнитное разделение, как это описано в шаге 1,10-1,12 с использованием новой колонке MS. Колонка MS меньше и более компактно, поэтому подвеска будет работать медленнее, через колонку, но дают более высокие цифры и чистоты клетки интерес.
15. Граф количества клеток для дальнейших экспериментов и проверки чистоты проточной цитометрии. Для изоляции восприимчиво передаются Т-клеток, такие как описанные в этом протоколе, аллельных маркеров для идентификации включают CD45 и Thy1.1 (передается клеткам) и Thy1.2 (хост Т-клетки).

3. Представитель Результаты

Выход частности клеточной популяции (например, макрофагов, округ Колумбия, Т-клеток и т.д.) будет меняться в зависимости от размера опухоли и лечение, которые были администратораistered во время роста опухоли. Предстательной железы с необработанными 14-16 неделя TRAMP мышь должна принести между ^5-8x10 1x10 ⁶ CD11c ⁺ / PDCA-1 ⁺ (DC) клеток на 90-95% чистоты или 1x10 ^{6-1.5x10 6} F4/80 ⁺ / CD11b ⁺ (макрофагами) на 80-90% чистоты от 300 мг ткани после изоляции выше протокол, как показано на рисунке 1. Количество каждого из этих клеток увеличивается на несколько приемных передачи опухолью антигены конкретных Т-клеток. Плохо чистоты, как правило, в результате недостаточного мытья, позволяющий колонке сушить (что может привести к опухоли удержания мусора в столбце), или недостаточная рецепторов Fc блокировки.

Кроме того, общее клетки, выделенные из опухоли B16 будет также варьироваться в зависимости от размера опухоли во время сбора урожая ткани и приемных передачи Т-клеток (передача 5x10 ⁶⁾ с или без вакцины DC (передача 1x10 ^5). Очень немногие антиген-спеcific Т-клетки проникают в опухоль, если антиген-импульсного DC вакцины также дается один день после передачи Т-клеток. Если вакцина DC вводят мыши несущие небольшой, осязаемый (<50 мм ²⁾ опухоли, выход примерно 3x10 ⁵ Thy1.1 ⁺ Т-клеток, с чистотой 80-85%, будет считаться "хорошим "собрать как показано на рисунке 2А. Однако, если большие опухоли собирают, общий выход и чистота будет снижена.

Макрофаги (F4/80 ⁺ / CD11b ^+), как правило, меньший процент от общей клетки опухоли B16. Рисунок 2B показывает, что использование CD11b, от опухоли, которая составляет 250 мм ^2, получается примерно 1x10 ⁶ макрофагов в 90-95% чистоты . Кроме того, на рисунке 2Б показывает, что население в DC B16 опухоли неоднородна. В отличие от опухоли простаты, две подгруппы: CD11c ⁺ / PDCA-1 ⁺ (plasmacytoid DC) и CD11c+ / PDCA-1 ^- (обычный DC) может быть получена из опухоли меланомы В16. По оценкам, 2х10 ⁶ PDC и 4x10 ⁶ CDC ожидается от 250 мм ² B16 опухоли на 80-90% чистоты. Снижение чистоты, как правило, результат не очищает клетки опухоли из колонки. Шаг 2.12 важный шаг, чтобы удалить маленький комок клеток меланомы, которая сохраняется в базе колонны. Вслед за этим шагом повышает эффективность промывания и приводит к повышению чистоты.

Рисунок 1. РС (CD11c ⁺ / PDCA-1 ⁺⁾ и макрофаги (F4/80 ⁺ / CD11b ⁺⁾ были изолированы от TRAMP опухоли предстательной железы. Значения Dot участок представляет процент клеток интерес пред-и пост-очистки.

Рисунок 2. (А) AdoptivЭли переданы Thy1.1 ⁺ / CD8 ⁺ Т-клеток и (B) миелоидных клеток, включая CD11c ⁺ / PDCA-1 ⁺ plasmacytoid DC, CD11c ⁺ / PDCA-1 ^- обычный РС и F4/80 ⁺ / ⁺ CD11b макрофаги были изолированы от подкожного меланома В16 опухоли мышей Thy1.2 ^+. Значения Dot участок представляет процент клеток интерес пред-и пост-очистки.

Обсуждение

Этот протокол может быть изменена, в зависимости от размера и источника опухоли (подкожно, спонтанные опухоли, или ортотопической опухоли). Для более крупных опухолей, рекомендуется увеличить размер буфера диссоциации, MAC-буфер, и число стирок. Сердечность клеток, выделенных может зависеть от TME, из которых они обогащаются. Например, в нашем опыте, клеток, выделенных из спонтанных опухолей предстательной железы требует мягкого, чем диссоциация клеток, выделенных из подкожных опухолей меланомы В16. Во время вскрытия опухоли, ликвидировать как много жировой, кожей или другим мусором, что может помешать эффективной ферментативной диссоциации. Очень важно, чтобы полностью переварить опухолевые массы и получения суспензии отдельных клеток, для обеспечения надлежащей маркировки Ab и предотвратить колонны от засорения. Для миелоидной изоляторе, количества фетальной телячьей сыворотки рекомендуется в буфер изоляции ПДК был увеличен с 2% до 10% для улучшения жизнеспособности клеток. Кроме того, эссеntial сохранить все буферы и клеток холодной всей протокол для предотвращения неспецифического связывания Ab и засорение колонки. В заключение, для получения обогащенного популяции антиген представляющих клеток и опухолевый антиген-специфических цитотоксических Т-лимфоцитов, мы изменили и оптимизированы на основе антител изоляции процедура использования технологии Miltenyi Biotech. Используя этот протокол, как восприимчиво передается и эндогенных лейкоцитов населения может быть обогащена использованием Abs направлена ​​против клетки определенного типа поверхностных маркеров. Одним из преимуществ описанной процедуры является уменьшение опухоли мусора переноса после продолжительных и строгих стирки. Это включает использование коллагеназы в промывочный буфер, а также определение точки, в которой дополнительное давление на столбец можно исключить колонку сабо на опухолевые клетки. Получение достаточного количества иммунных клеток из тканей, особенно в чистоте, которая подходит для функционального анализа, может быть трудной задачей.Однако, по нашему опыту, протокол здесь дает самое большое число клеток, в наибольшей чистоте, с самой последовательности.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Реагенты О компании Количество Catalouge Комментарии
Я коллагеназы	Gibco	17100-017	Использовать при выборе для Т-клеток
Коллагеназы IV	Gibco	17104-019	Используйте для миелоидной выбор
ДНКазы	Calbiochem	260913
RPMI	Gibco	21 870
Дульбеко PBS	Lonza	17-5158
Фетальной телячьей сыворотки	Lonza	14-501F
ПДК буфер			2% FBS для Т-клеток 10% FBS для клеток миелоидной
Thy1.1 PE	Ebioscience	551401
Anti-PE микрошарики	Miltenyi Biotech	120-000-294
Защита от Pan DC микрошарики	Miltenyi Biotech	120-003-183
Защита от CD11b микрошарики	Miltenyi Biotech	120-000-300
LC колонка	Miltenyi Biotech	130-042-202
MS колонка	Miltenyi Biotech	130-042-201