Методическая статья

В пробирке Электропорация нижней губы Ромбическая эмбрионов мыши середине беременности

10K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/3983

⸱

3 августа 2012 г.

 ,  ,  , 
1Biology Department, University of Illinois at Springfield

В этой статье

Краткое содержание

Данное исследование описывает развитие В пробирке Электропорации метод, который позволяет для манипуляций экспрессии генов в нижней губе ромбической середине беременности эмбрионов.

Аннотация

Ромбовидная губа представляет собой эмбриональный нейроэпителий, расположенный в заднем мозге на границе между нейральной трубкой и крышей четвертого желудочка (обзор представлен в 1). Ромбовидную губу можно разделить на верхнюю ромбовидную губу (URL), которая охватывает ромбомер 1 (r1) и дает начало нейронам мозжечка, и нижнюю ромбовидную губу (LRL), из которой развиваются различные нейрональные линии ствола мозга 2-4. Производные LRL включают слуховые нейроны улитковых ядер, а также нейроны прецеребеллярных ядер, участвующие в регуляции равновесия и моторного контроля 5-8. Нейрогенез из LRL происходит в течение длительного временного окна, охватывающего эмбриональные дни (E) 9,5–16,55, 9. Различные нейрональные линии возникают из LRL по мере того, как постмитотические клетки (или «рождаются») в разные дни развития в течение этого нейрогенного окна.

Электропорация конструктов для экспрессии генов может быть использована для манипулирования экспрессией генов в клетках-предшественниках LRL и потенциально может изменить судьбу нейронов, образующихся в этой области 10-12. Изменение экспрессии генов предшественников LRL у мыши с помощью электропорации in utero оказалось весьма эффективным для манипулирования линиями клеток, закладывающимися на embryonic day E12.5 или позже 10, 12-14. Электропорация in utero до E12.5 была безуспешной главным образом из-за летальности, связанной с проколом крыши четвертого желудочка, что является необходимым этапом доставки экзогенной ДНК, которая электропорируется в LRL. Однако многие клеточные линии, происходящие из LRL, закладываются в LRL раньше E12.5 9. Эти более ранние линии включают нейроны, составляющие латеральное ретикулярное, наружное клиновидное и нижнее оливное ядра прецеребеллярной системы, которые обеспечивают передачу сигналов из спинного мозга и коры в мозжечок 5. Чтобы манипулировать экспрессией в LRL эмбрионов моложе E12.5, мы разработали систему in vitro, в которой эмбрионы помещаются в культуру после электропорации.

В данном исследовании представлен эффективный и действенный метод манипулирования экспрессией генов предшественников LRL на стадии E11.5. Эмбрионы, подвергнутые электропорации плазмидой с зеленым флуоресцентным белком (GFP) под управлением широко активного промотора CAG, воспроизводимо экспрессировали GFP после 24 часов культивирования. Критически важным аспектом данного анализа является то, что экспрессия генов изменяется исключительно за счет экспрессии экзогенного гена, а не вследствие вторичных эффектов, вызванных электропорацией или методами культивирования. Было установлено, что паттерны экспрессии эндогенных генов в электропорированных и культивируемых эмбрионах остаются неизменными. Данный анализ может быть использован для изменения судьбы клеток, развивающихся из LRL эмбрионов младше стадии E12.5, путем введения плазмид для гиперэкспрессии или нокдауна (с помощью РНК-интерференции) различных проневральных факторов транскрипции.

Протокол

1. Подготовка Перед Электропорация

  1. Усилить ДНК для электропорации на макси приготовительный (премьер-It или Qiagen). Концентрация ДНК должна быть не менее 1 мг / мл для эффективного поглощения.
  2. Удалить 495 мкл ДНК и смешайте с 5 мкл 0,01% Быстрый зеленый в 1 X PBS (фосфатный буферный раствор) в микроцентрифуге трубку.

2. Эмбриональные урожая

  1. Создание приурочено вязки из CD-1 мышей (Харлан). Проверьте наличие вагинальной пробки и считают датой вагинальный вилка наблюдается эмбриональный день (E) 0.5. Эмбрионы будут собраны 11 дней после визуализации плагин (E11.5).
  2. Поместите стерилизовать инструменты в 70% этаноле. Лечить капот ламинарного потока УФ-светом, по крайней мере за час до использования. Спрей капюшоном, рассекая лоток и рассекает область с 70% этанола. Разогреть 1 X PBS до 37 ° C.
  3. На E11.5 усыпить женщина в соответствии с условиями, утвержденными в ИнститутеРациональная Комитета по уходу и использованию животных (ICCUA). Место вскрытия лоток в ламинарном боксе. Спрей вниз живота женщины с 70% этанола.
  4. Откройте в брюшную полость и прикрепить к стенам рассечения лоток. Вытяните рога матки, так что она покоится в брюшную полость.
  5. Аккуратно разрезать стену рога матки. Используйте 20 мм ложка (Fine научно Tools), чтобы мягко удалить эмбрион в желточный мешок от плаценты. Место эмбрионов в 100 мм блюдо культуры ткани заполнено 10 мл стерильной 1 X PBS, которая подогревается в 2.2.
  6. Повторите эти действия для всех эмбрионов настоящее время.

3. Электропорация эмбрионов E11.5 (рис. 1)

  1. Использование 20 мм ложкой, передавать первый зародыш нового 100 мм блюдо заполнено 10 мл стерильной 1XPBS, который нагревается до 37 ° C.
  2. Используйте пинцет 11 см с 0,05 х 0,02 мм наконечник (Fine Научные инструменты) тщательно повторнодвигаться и отказаться от желтка.
  3. Позиция эмбрион так, что его спинной стороной вверх так, что он похож на мультфильм на рисунке 1а. Используйте 7 мм электрод весла (Harvard аппарата) аккуратно провести эмбриона. Электроды должны быть расположены по обе стороны нервной трубки на уровне заднего мозга четвертого желудочка. Желудочек видна невооруженным глазом, но с помощью вскрытия микроскоп может способствовать точного размещения весло. Позиционирование весла имеет решающее значение для определения области, который получает электропорации ДНК. Если нижняя губа ромбическая (НПН) спинного эмбриональных задний мозг желательно, весла должна быть местом, что они непосредственно фланговые самой широкой части четвертой открытия желудочка.
  4. Используйте 1 мл шприц, чтобы составить плазмидной ДНК смешивается с 0,01% Быстрый зеленый. 500 мкл смеси должна быть достаточной для электропорации по крайней мере, 8-10 эмбрионов (см. 3.5).
  5. Аккуратно проколите roofplate овerlying четвертого желудочка с 25G 5/8 туберкулин иглы прикреплен к 1 мл шприц и ввести ДНК-краситель смесь в желудочке. Успешное инъекций характеризуется ДНК-краситель смесь заполнение всей системы желудочков (рис. 1в). Количество ДНК-краситель смесь обычно вводят менее 50 мкл. Точные суммы переменных между эмбрионами, так как часть смеси, как правило, утечка из желудочка в PBS окружающих эмбрион. Альтернативный способ доставки ДНК-краситель смесь будет через доступ к желудочковой системы выкалыванием парус покрывающей мозга. Опять же, успешный инъекций характеризуется ДНК-краситель смесь заполнение всей системы желудочков.
  6. Доставка пяти квадратных импульсов с помощью электрического генератора импульсов (BTX) и 7 лопастей мм электрод. Каждый импульс 50 В длительностью 5 мс на импульс 500 мс между каждым импульсом. Ткани ближе к положительно заряженному электроду будет то TakЕ до плазмиды.

4. Культура эмбрионов

  1. В ламинарном боксе, заполните внешней лунки 12-луночного культуры блюдо с 2 мл DMEM/F12 среде с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 5% лошадиной сыворотки, 1% глутамина, 1% пенициллин / стрептомицин, который подогревается до 37 ° C. Культура условия были адаптированы с Диего и его коллеги 15.
  2. В ламинарного потока капот щепотку эмбрионов на миделе (до сердца) щипцами и удалить задней части эмбриона. Поместите переднюю часть в одном из заполненных ям 12 и культура блюдо.
  3. Повторите эти действия для всех эмбрионов. Заполните только внешний скважин 12-луночного планшета, чтобы избежать загрязнения культур.
  4. Культура эмбрионов в 37 ° C инкубатор с 5% CO 2. Выражение электропорации плазмиды должны наблюдаться в течение 24 часов.
  5. Если больше культуры раз лучшего, заполнить из скважины нового 12-луночный планшет с 2 млсредства массовой информации используются в 4.1. С стерилизованной ложкой передачи эмбрионов и в новой пластинке. Положите обратно в 37 ° C инкубатора. Культуры до 48 часов возможно.
  6. Когда желаемая культуры время будет достигнута, исправить эмбрионов для анализа (см. ниже).

5. Подготовка эмбрионов для анализа

  1. Промойте эмбрионы в 1 X PBS при 4 ° С в течение пяти минут. Повторите.
  2. Исправить эмбрионы на анализ в 2% параформальдегида (PFA) в 1XPBS в течение 2 часов при температуре 4 ° C.
  3. Промойте эмбрионы в 1 X PBS при 4 ° С в течение пяти минут. Повторите.
  4. Равновесие эмбрионов в 30% сахарозы в 1 X PBS в течение ночи при 4 ° C.
  5. Вставить эмбрионов в Оптимальная температура резания (ОКТ) соединения с использованием сухого льда / этанол ванну. Эмбрионы могут храниться при температуре -20 ° C.
  6. Раздел эмбрионов на криостат (Leica) в 30 мкм разделы и смонтировать на слайдах (VWR, SuperFrost Plus). Хранить при температуре -20 ° C.

6. ИммунитетАнализ nohistochemistry

  1. Иммуногистохимическое проводили, как описано в 16. Первичное разведение антител для исследования включают кролика α-GFP (Invitrogen) 1:2500; мышь α-Mash1 (BD Biosciences) 1:100; кролика α-Ngn1 (Jane Johnson) 1:5000; кролика α-Ptf1a (Джейн Джонсон ) 1:2500; кролика Math1 (Jane Johnson) 1:100. Инкубировать слайд квартиры, образец вверх на лоток окрашивания при температуре 4 ° С в течение ночи.
  2. Слайды были проанализированы на сложный микроскоп (Olympus BX51).

7. Представитель Результаты

Схема на рисунке 1а изображен электропорации эксперимента. Рисунок 1B показывает сагиттальный вид эмбриона E11.5 до манипуляции. То же эмбрион после введения плазмиды, содержащей CAG :: GFP в 0,01% Быстрый зеленый показано на рисунке 1С, а также представитель незаписанных эмбриона выставке одностороннем GFPвыражение в спинном задний мозг 24 часа в сутки следующие культура показана на рис 1D. Протяженность области LRL, успешно электропорации является переменной и, похоже, сильно зависит от расположения электродов. В наших исследованиях было установлено, что 52 из 65 (80%) электропорации эмбрионы успешно выразил GFP. Ткань была сочтена успешной электропорации, если он был положительным для GFP в локализованных областях в течение нескольких разделов после записи и иммуногистохимического анализа (см. ниже). Эмбрионы, которые не отвечают этим критериям оценивались как неудачные попытки электропорации.

Дальнейшая оценка эффективности электропорации может быть установлена ​​путем проведения иммуногистохимии против GFP на поперечных сечений электропорации эмбрионов на уровне четвертого желудочка. На рисунке 2 показан представитель серийных срезов из эмбриона отображения односторонниеGFP выражении. Рисунок 2А показывает идеализированную схему, которая иллюстрирует, что в левой части зародыша к положительному электроду. Поперечные сечения (на уровне представлены к середине мультфильма Рисунок 2А) выявить локализованные выражения GFP исключительно на левой стороне заднего мозга ткани (рис. 2С и 2D). Электропорации области LRL не распространяется весь передне-задней оси нервной трубки, как изучение разделов 300 мкм ростральной или больше, показанной на рис 2С не выражает GFP (рис. 2В).

Полезность этого анализа для манипуляций экспрессии генов зависит от стабильности выражения доменов эндогенных белков. LRL был охарактеризован как обладающий уникальными области предшественников характеризуется дифференциальным выражением proneural транскрипционных факторов (см. обзор 1).Некоторых из этих факторов (Mash1, Math1, Ngn1 и Ptf1a) были выбраны для анализа в связи с их предлагаемых и / или характеризуется роль в спецификации precerebellar нейронных подтипов в LRL, предмет будущих исследований 16-18. Все четыре белки имеют очень характерное выражение в области хвостового задний мозг на E11.5 16-18. Мы заметили, что эмбрионы, которые были размещены культуры удалось увеличить в размерах и также не смогли начать производство сосудистое сплетение эпителия и инвагинации LRL и roofplate, морфологических событий, которые происходят между E11.5 и E12.5 5. На основании этих наблюдений было установлено, что нормальное развитие в этих эмбрионов был остановлен или грубой задержкой и сопоставимых управления культурным эмбрионы должны быть некультурным эмбрионов на E11.5.

Для того, чтобы культура и электропорации не беспокоить уровни эндогенных белков, мы проанализировали четыре различных белков immunohistochemistry (IHC) в 34 различных эмбрионов, которые были электропорации и культурный, по крайней мере 24 часов. В таблице приведено количество эмбрионов проанализированы для каждого маркера и процент эмбрионов проанализированы, которые сохранили нормальный уровень белка. На рисунке 3 показан представитель IHC данных из двух белков проанализированы Mash1 (рис. 3A и 3B) и Math1 (рис. 3C и 3D). Мы заметили, что большинство эмбрионов сохранить нормальный уровень экспрессии после электропорации и культуры (рис. 3B и 3D) по сравнению с контролем эмбрионов на E11.5 (рис. 3А и 3С). Важно отметить, что характеристика областей экспрессии этих белков не возмущается.

figure-protocol-1
Рисунок 1. Электропорация эмбрионов в E11.5. (А) Схема йЭксперимент электронной электропорации. E11.5 эмбриона выделяют и выражения плазмиды в 0,01% Быстрый зеленый вводится в четвертый желудочек. Эмбрион, то в окружении электрод весла и подвергается 50 V импульса до того, как помещается в культуре (B) Сагиттальный зрения эмбриона E11.5 перед инъекцией. (C) E11.5 же эмбрион после введения плазмиды в 0,01% Быстрый зеленый. (D) Односторонние выражение задний мозг из GFP наблюдали в зародыше E11.5 после 24 часов культуры. MB-мозга; 4v четвертый желудочек.

figure-protocol-2
Рисунок 2. Экспрессия GFP в электропорации тканей. (A) мультфильм слева изображен размещения электродов вокруг эмбриона E11.5. Средние мультфильм изображает поглощение и экспрессия GFP плазмида кодирования на левой стороне зародыша. Мультфильм по праву является схема идеализированный поперечного сечения, сделанные через эмбрион на лEvels обозначаются черными линиями в середине мультфильма. (B-D) для иммуногистохимического GFP на поперечных срезах через электропорации эмбриона E11.5 после 24 часов культуры. Стрелки указывают на roofplate (РП), который задерживает вторичными антителами. Изображения, принятые на 10-кратным увеличением. Относительные уровни разделах показано изображены горизонтальные линии через середину мультфильма в (A). MB-мозга; л 4v четвертый желудочек; RP-roofplate.

figure-protocol-3
Рисунок 3. Экспрессия эндогенных белков в Нижнем Ромбическая губ Immunohistochemistry для Mash1 (А и В) или Math1 (C и D) по сравнению поперечном сечении эмбрионов E11.5, которые не были культурными (A, C) с эмбрионами, которые были электропорации с CAG.: : GFP и культивировали в течение 24 ч (B и D). Изображения, полученные в 10-кратным увеличением.

Proneural Transcriptiна фактор Проанализированы Количество эмбрионов Проанализированы Процент сохранение нормальной структуре выражения
Math1 15 86,7%
Mash1 12 83,3%
Ngn1 7 71,4%
Ptf1a 6 100%

Таблица I. Процент электропорации и искусственного Эмбрионы сохранение нормального Proneural фактора транскрипции доменов в LRL.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В пробирке электропорации техники, представленные в данном исследовании является новой методологии, которая может быть эффективно использован для управления экспрессией генов в эмбрионах моложе 12 дней беременности. Размещение эмбрионов в культуре позволяет выражение гена и обходит летальность наблюдается при электропорации эмбрионов разрешено остаться в естественных условиях. Этот метод позволяет для манипуляций экспрессии генов в эмбриональных предшественников, которые ранее были недоступны для элект...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить Джейн Джонсон Math1, Ngn1 и Ptf1a антител и Конни Cepko для pCAG :: GFP плазмиды. Эта работа финансировалась NIH R15 1R15HD059922-01.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Название реагента Компания Номер по каталогу Комментарии (опционально)
Криостат Leica CM-1850
Biologie кончик Dumoxel лечение DUMONT щипцы Изобразительное научных инструментов 11252-30
20 мм MORIA перфорированной ложкой Изобразительное научных инструментов 10370-17
ECM 830 квадратных волна Электропорация генератор BTX (VWR) 47745-928
Гарвардский Аппарат 7 мм Tweezertrodes * Электроды BTX (Фишер) BTX450165
Фишер Isotemp CO 2 инкубатор Рыбак 1325525
NAPCO CO 2 газового регулятора Рыбак 15497020
12 луночных культуры тканей BD Falcon (Фишер) 877229
Hyclone жидких сред DMEM/F-12 (1:1), с L-глютамин и HEPES, 500 мл Thermo Scientific (Фишер) SH3002301
Hyclone * Доноры лошадей сыворотки Thermo Scientific (Фишер) SH3007402
Эмбриональной телячьей сыворотки, квалифицированные, тепло инактивированная Invitrogen 16140-063
CellGro * 10000 МЕ пенициллин, 10000 мкг / мл стрептомицина Mediatech (Фишер) MT-30-002-ДИ
Hyclone * L-глютамин L-глютамина, 200mm в 0,85% NaCl Thermo Scientific (Фишер) SH3003401
Быстро-зеленый Рыбак AC41053-0250 0,01%

Ссылки

  1. Ray, R. S., Dymecki, S. M. Rautenlippe Redux -- toward a unified view of the precerebellar rhombic lip. Current opinion in cell biology. 21, 741-747 (2009).
  2. Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48, 17-24 (2005).
  3. Wingate, R. J. The rhombic lip and early cerebellar development. Curr. Opin. Neurobiol. 11, 82-88 (2001).
  4. Wingate, R. J., Hatten, M. E. The role of the rhombic lip in avian cerebellum development. Development (Cambridge, England). 126, 4395-4404 (1999).
  5. Altman, J., Bayer, S. A. Development of Cerebellar System: In relation to its evolution, structure, and function. , CRC Press, Inc. Boca Raton. (1997).
  6. Farago, A. F., Awatramani, R. B., Dymecki, S. M. Assembly of the brainstem cochlear nuclear complex is revealed by intersectional and subtractive genetic fate maps. Neuron. 50, 205-218 (2006).
  7. Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum. Neuron. 48, 31-43 (2005).
  8. Rodriguez, C. I., Dymecki, S. M. Origin of the precerebellar system. Neuron. 27, 475-486 (2000).
  9. Taber-Pierce, E. Histogenesis of the nuclei griseum ponitis, corporis pontobulbaris and reticularis tegmenti pontis (bechterew) in mouse. J. Comp. Neurol. 126, 219-240 (1966).
  10. Dipietrantonio, H. J., Dymecki, S. M. Zic1 levels regulate mossy fiber neuron position and axon laterality choice in the ventral brain stem. Neuroscience. 162, 560-573 (2009).
  11. Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70, 155-162 (2002).
  12. Taniguchi, H., Kawauchi, D., Nishida, K., Murakami, F. Classic cadherins regulate tangential migration of precerebellar neurons in the caudal hindbrain. Development (Cambridge, England). 133, 1923-1931 (2006).
  13. Kawauchi, D., Taniguchi, H., Watanabe, H., Saito, T., Murakami, F. Direct visualization of nucleogenesis by precerebellar neurons: involvement of ventricle-directed, radial fibre-associated migration. Development (Cambridge, England). 133, 1113-1123 (2006).
  14. Okada, T., Keino-Masu, K., Masu, M. Migration and nucleogenesis of mouse precerebellar neurons visualized by in utero electroporation of a green fluorescent protein gene. Neuroscience research. 57, 40-49 (2007).
  15. de Diego, I., Kyriakopoulou, K., Karagogeos, D., Wassef, M. Multiple influences on the migration of precerebellar neurons in the caudal medulla. Development (Cambridge, England). 129, 297-306 (2002).
  16. Landsberg, R. L. Hindbrain rhombic lip is comprised of discrete progenitor cell populations allocated by Pax6. Neuron. 48, 933-947 (2005).
  17. Hoshino, M. Ptf1a, a bHLH transcriptional gene, defines GABAergic neuronal fates in cerebellum. Neuron. 47, 201-213 (2005).
  18. Yamada, M. Origin of climbing fiber neurons and their developmental dependence on. Ptf1a. J. Neurosci. 27, 10924-10934 (2007).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи