Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Направленной дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток по отношению к Т-лимфоцитов

18.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/3986

⸱

14 мая 2012 г.

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Pennsylvania State University College of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Получение T-лимфоцитов из индуцированных плюрипотентных стволовых (иПС) клеток представляет собой альтернативный подход использованию эмбриональных стволовых клеток для T-клеточной иммунотерапии. Данный метод демонстрирует, что при использовании систем индукции in vitro или in vivo иПС-клетки способны дифференцироваться как в конвенциональные, так и в антигенспецифические T-лимфоциты.

Аннотация

Адоптивный перенос клеток (ACT) антигенспецифических CD8+ цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) является перспективным методом лечения различных злокачественных новообразований 1. ЦТЛ способны распознавать злокачественные клетки путем взаимодействия опухолевых антигенов с Т-клеточными рецепторами (TCR), после чего высвобождают цитотоксины и цитокины для уничтожения этих клеток. Известно, что наименее дифференцированные ЦТЛ и ЦТЛ с фенотипом центральной памяти (определяемые как высокореактивные) являются оптимальной популяцией для иммунотерапии на основе ACT, поскольку такие ЦТЛ обладают высоким пролиферативным потенциалом, менее склонны к апоптозу, чем более дифференцированные клетки, и имеют более высокую способность отвечать на гомеостатические цитокины 2-7. Однако в связи с трудностями получения большого количества таких ЦТЛ от пациентов существует острая необходимость в поиске нового подхода к генерации высокореактивных Ag-специфических ЦТЛ для успешного проведения терапии на основе ACT.

Трансдукция TCR в самообновляющиеся стволовые клетки для иммунной реконституции обладает терапевтическим потенциалом для лечения заболеваний 8-10. Однако подход, основанный на получении эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) от пациентов, неосуществим. Хотя использование гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) в терапевтических целях широко применяется в клинике 11-13, ГСК обладают сниженной дифференцировочной и пролиферативной способностью, а их экспансия в культуре клеток in vitro затруднена 14-16. Современная технология получения иПСК и разработка системы доставки генов in vitro позволяют генерировать иПСК от пациентов без какого-либо хирургического вмешательства. Кроме того, подобно ЭСК, иПСК обладают неограниченной пролиферативной способностью in vitro, и было показано, что они способны дифференцироваться в гемопоэтические клетки. Таким образом, иПСК обладают более высоким потенциалом для использования в иммунотерапии на основе ACT по сравнению с ЭСК или ГСК.

В данной работе мы представляем методы получения T-лимфоцитов из иПСК in vitro, а также программирование антигенспецифических ЦТЛ из иПСК in vivo для усиления иммунного надзора при раке. Стимуляция in vitro лигандом Notch индуцирует дифференцировку Т-клеток из иПСК, а трансдукция гена TCR приводит к дифференцировке иПСК в антигенспецифические Т-клетки in vivo, что предотвращает рост опухоли. Таким образом, мы демонстрируем дифференцировку иПСК в антигенспецифические Т-клетки. Наши исследования предлагают потенциально более эффективный подход к получению антигенспецифических ЦТЛ для терапии на основе адоптивного переноса Т-клеток (ACT) и способствуют разработке терапевтических стратегий лечения заболеваний.

Протокол

1. Культивирование клеток

  1. Подготовка облученных фидерных клеток SNL76/7 (irSNL76/7) для культивирования.
    Клетки SNL76/7 обычно поддерживают в среде DMEM (модифицированная среда Игла в модификации Дульбекко) с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS).
    1. Чашку или флакон для культивирования покрывают 0,1% раствором желатина при 37 °C в инкубаторе в течение 30 минут перед извлечением клеток SNL76/7 из жидкого азота.
    2. При достижении клетками SNL76/7 конфлюэнтности их отделяют трипсинизацией, центрифугируют при 400 g в течение 5 мин и ресуспендируют в свежей среде.
    3. Ресуспендированные клетки SNL76/7 облучают в 60Co-ирадиаторе с дозой 5000 Rads.
      В качестве альтернативного подхода клетки SNL76/7 можно заменить эмбриональными фибробластами мыши (MEF), а облучение — инактивацией митомицином.
    4. После облучения клетки центрифугируют при 400 g в течение 5 мин, ресуспендируют в буфере для замораживания, состоящем из FBS и 10% диметилсульфоксида (DMSO), раздают по криопробиркам и хранят в жидком азоте для дальнейшего использования.
  2. Подготовка клеток OP9-DL1 для дифференцировки in vitro.
    Клетки OP9-DL1 обычно поддерживают в среде α-MEM (минимальная эссенциальная среда α) с добавлением 20% FBS. При достижении конфлюэнтности клетки пересевают в разведении 1:5.
  3. Подготовка клеток тимомы E.G7.
    Клетки тимомы E.G7 обычно поддерживают в среде RPMI-1640 (среда Института памяти Розуэлла Парка) с добавлением 10% FBS. При достижении конфлюэнтности клетки пересевают в разведении 1:10.
  4. Общее содержание и поддержка иПСК и TCR-трансдуцированных иПСК.
    1. Чашку для культивирования покрывают 0,1% раствором желатина при 37 °C в течение 30 минут перед высевом фидерных клеток irSNL76/7, который проводят за один день до размораживания или пересева иПСК.
    2. Для пересева иПСК клетки отделяют трипсинизацией, центрифугируют при 400 g в течение 5 мин и ресуспендируют в среде DMEM с 15% FBS.
    3. Трипсинизированные иПСК инкубируют в новой чашке для культивирования в течение 30 минут в инкубаторе при 37 °C перед высевом на свежую предварительно покрытую фидерными клетками irSNL76/7 чашку, чтобы исключить дифференцированные клетки и остатки фидерных клеток.
    4. После инкубации 4×106 клеток высевают в чашку для культивирования диаметром 100 мм.

2. Программирование in vitro

  1. Система совместного культивирования in vitro.
    1. В день 0 5x104 иПСК высевают в чашку для культивирования 100 мм, содержащую конфлюэнтный монослой клеток OP9-DL1 в среде α-MEM с 20% FBS.
    2. На 3-й день культуральную среду заменяют свежей.
      1. На 5-й день клетки снимают с поверхности трипсинизацией и центрифугируют при 400 g в течение 5 мин, после чего инкубируют в свежей чашке для культивирования 100 мм в течение 30 минут в инкубаторе при 37 °C.
      2. Собрали и подсчитали плавающие клетки; 5x105 клеток переносят в свежую чашку для культивирования, содержащую конфлюэнтный монослой клеток OP9-DL1 в среде α-MEM с 20% FBS. В культуру добавляют цитокин mFlt-3L (конечная концентрация: 5 ng/mL).
      1. На 8-й день слабо прикрепившиеся клетки осторожно снимают с поверхности с помощью пипетки.
      2. Слой-фидер OP9-DL1 промывают 10 mL PBS еще раз для максимального извлечения частично дифференцированных иПСК.
      3. После сбора клеток из совместной культуры их центрифугируют при 400 g в течение 5 мин и ресуспендируют в среде α-MEM с 20% FBS, дополненной mFlt-3L (5 ng/mL) и mIL-7 (1 ng/mL).
      4. Клетки переносят в 6-луночный планшет для культивирования, покрытый конфлюэнтными клетками OP9-DL1. Обычно иПСК, полученные из одной чашки 100 мм, переносят в одну лунку 6-луночного планшета.
      1. Начиная с 10-го дня, культуральную среду заменяют через день (среда α-MEM с 20% FBS, дополненная mFlt-3L (5 ng/mL) и mIL-7 (1 ng/mL)).
      2. Планшеты для культивирования, покрытые фидерными клетками OP9-DL1, меняют каждые 4-6 дней в зависимости от роста фидерных клеток.
  2. Созревание частично дифференцированных иПСК in vivo.
    1. На 22-й день совместного культивирования иПСК снимают трипсинизацией, центрифугируют при 400 g в течение 5 мин и инкубируют в свежей чашке для культивирования при 37 °C в течение 30 минут.
    2. Собрали плавающие клетки, пропустили их через нейлоновый фильтр 70 μm для удаления клеточных агрегатов, которые могут вызвать тромбоэмболию легочной артерии у мышей, и трижды промыли в холодном PBS.
    3. Клетки ресуспендируют в PBS до концентрации 1.5x107 клеток/mL.
    4. Клетки хранят на льду до момента инъекции.
    5. Перед внутривенной (i.v.) инъекцией в хвостовую вену мышей помещают под инфракрасную лампу для расширения хвостовой вены.
    6. После расширения вены 200 μl клеточной суспензии или 3x106 клеток адаптивно переносят в хвостовую вену 4-недельной мыши линии B6.129S7-Rag1tm1Mom/J. Для созревания частично дифференцированных иПСК in vivo выдерживают три недели.
  3. Оценка.
    1. Морфологические изменения дифференцированных клеток и скорость восстановления клеток. Рисунок 1.
      1. На разные дни совместного культивирования с клетками OP9-DL1 делают снимки живых клеток с помощью обычного микроскопа.
      2. Скорость восстановления клеток рассчитывают на основе количества клеток, собранных из культуры.
    2. Проточный цитометрический анализ изменений поверхностных маркеров. Рисунок 2a.
      1. На разные дни совместного культивирования клетки удаляют из культуры путем трипсинизации и промывают холодным PBS перед окрашиванием поверхности клеток.
      2. Перед окрашиванием антителами, конъюгированными с различными флуорохромами, клетки блокируют Fc-блокатором 24G2 при 4 °C в течение 20 минут.
      3. После 20-минутного окрашивания при 4 °C клетки трижды промывают в холодном PBS перед анализом методом проточной цитометрии.
    3. Активация иПСК, дифференцированных in vitro. Рисунок 2b.
      1. За один день до анализа активации 24-луночный планшет покрывают анти-CD3 (конечная концентрация: 4 μg/mL в PBS) при 4 °C на ночь.
      2. На 22-й день совместного культивирования полученные из иПСК Т-клетки собирают из культуры и промывают холодным PBS перед стимуляцией анти-CD3, нанесенным на планшет, и растворимыми антителами анти-CD28 (конечная концентрация: 4 μg/mL).
      3. Инкубацию проводят в инкубаторе при 37 °C, 5% CO2 в течение 40 часов, после чего в культуру добавляют бефелдин А еще на 4 часа.
      4. По окончании совместного культивирования клетки собирают, промывают и блокируют Fc-блокатором, как описано выше. Заблокированные клетки окрашивают на поверхностные маркеры, такие как CD8 и цепь TCR Vβ, с использованием конъюгированных с флуорохромом антител.
      5. После окрашивания поверхности клеток их фиксируют 4% формальдегидом и пермеабилизируют с помощью набора для пермеабилизации Biolegend.
      6. После пермеабилизации внутриклеточные молекулы, такие как IL-2 и IFN-γ, окрашивают с помощью конъюгированных с флуорохромом антител.
      7. Перед окончательным анализом методом проточной цитометрии клетки трижды промывают в холодном PBS для удаления избытка антител.
    4. Созревание у мышей Rag-/-.
      1. После трех недель развития in vivo мышей Rag-/- усыпляют, извлекают селезенку и лимфатические узлы.
      2. Одиночные клетки получают путем механического разрушения. Эритроциты лизируют с помощью буфера для лизиса ACK, после чего собирают мононуклеары и дважды промывают в холодном PBS.
      3. После промывки клетки блокируют Fc-блокатором 24G2 при 4 °C в течение 20 минут, затем окрашивают различными конъюгированными с флуорохромом антителами анти-CD3, анти-CD4, анти-CD8 и анти-TCRβ при 4 °C в течение 20 минут.
      4. По окончании окрашивания клетки трижды промывают в холодном PBS перед анализом методом проточной цитометрии.

3. Программирование in vivo

  1. Создание ретровирусной конструкции.
    1. Вектор MSCV-IRES-DsRED (MiDR) сконструирован на основе вектора MSCV-IRES-GFP путем замены гена GFP геном DsRED.
    2. Ген Т-клеточного рецептора OT-I субклонируют в вектор MiDR для создания конструкции OT-I/MiDR.
  2. Ретровирусная трансдукция и сортировка клеток.
    1. Клетки упаковки Plat-E используются для получения псевдовирусов, которые будут применяться для последующей трансдукции.
      1. 3x106 Клетки Plat-E высевают в чашку для культивирования диаметром 100 мм за один день до трансфекции.
    2. В день 0 клетки Plat-E трансфецируют плазмидой OT-I MiDR с использованием реагента для трансфекции GeneJamma.
    3. В 1-й день 1x106 иПСК высевают в одну лунку 24-луночного планшета, предварительно покрытого 0,1% раствором желатина.
      1. На 2-й день супернатант, содержащий псевдовирусы, будет собран из культуры Plat-E и пропущен через 0.4 μm фильтровать для удаления потенциальных загрязняющих веществ.
      2. Трансдукцию будут проводить в условиях 32 °C центрифугируйте при 1400 об/мин в течение 1 часа в присутствии 5 μg/ml полибрен
      3. После трансдукции с использованием центрифугирования клетки помещают в 32 °C, 5% CO22 инкубировать в течение ночи.
    5. На 3-й день повторите процедуру трансдукции, описанную для 2-го дня. Для последующего использования будет подготовлен 6-луночный планшет с предварительным нанесением фидерных клеток irSNL76/7.
    6. На 4-й день трансдуцированные иПСК снимают с подложки с помощью трипсина, центрифугируют при 400 g в течение 5 мин и высевают на предварительно нанесенные фидерные клетки irSNL76/7.
    7. При достижении конфлюэнтности клетки отделяют с помощью трипсина, центрифугируют при 400 g в течение 5 мин и подготавливают к сортингу. Клетки, двойные положительные по GFP и DsRED, сортируют на клеточном сортере MoFlo. Отсортированные клетки культивируют на фидерных клетках irSNL76/7 для последующего использования.
  3. Адоптивный перенос и введение опухолевых клеток.
    Клетки iPS, трансдуцированные TCR мышей линии OT-I (OT-I/iPS), обычно поддерживают на фидерных клетках irSNL76/7, как описано выше.
    1. В день адаптивного переноса клетки OT-I/iPS отделяют с помощью трипсинизации, центрифугируют при 400 g в течение 5 мин и ресуспендируют в свежей среде.
    2. инкубация в течение 30 минут в чашке с новой культурой в 37 °C инкубатор необходим для удаления дифференцированных клеток и остаточных фидерных клеток.
    3. По окончании инкубации следует собрать плавающие клетки и центрифугировать их при 400 g в течение 5 мин.
    4. Осадок клеток промоют холодным PBS трижды, после чего клетки пропустят через 70 μm нейлоновый фильтр между двумя промывками для удаления клеточных агрегатов (двойная фильтрация).
    5. После промывки клетки подсчитывают и ресуспендируют в холодном PBS до концентрации 1,5x10^6 клеток/мл.7 клеток/мл.
    6. Перед инъекцией клетки следует хранить на льду.
    7. Для адаптивного переноса будут использованы самки мышей линии C57BL/6J в возрасте 4–6 недель. Перед в/в для осуществления инъекции в хвостовую вену мышей помещают под инфракрасную лампу для расширения вен хвоста.
    8. После расширения вены, 200 μl суспензия клеток или 3x106 клетки будут перенесены адаптивно через хвостовую вену. В течение шести недель будет предоставлено время для in vivo созревание индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, трансдуцированных ТКР мышей линии OT-I.
      1. После шести недель в/в инъекция, 4x106 Клетки тимомы E.G7 будут введены внутрибрюшинно.
      2. Клетки тимомы E.G7 будет собрано из культуры и промыто трижды в PBS.
      3. По завершении промывки клетки суспендируют в холодном PBS до концентрации 8x107 клеток/мл.
      4. 50 μl суспензия клеток или 4x106 клетки будут введены в брюшную полость.
  4. Оценка.
    1. In vitro характеристика iPS-клеток, трансдуцированных TCR OT-I.
      1. Флуоресцентная микроскопия клеток, двойных положительных по DsRED и GFP, будет проведена с использованием стандартного флуоресцентного микроскопа на неффиксированных живых клетках.
      2. Интеграция и экспрессия гена будут проанализированы с помощью ПЦР и ОТ-ПЦР.
        1. Клеточную ДНК или РНК будут изолировать из образцов раздельно с использованием набора для изоляции ДНК или РНК компании Qiagen.
        2. ПЦР и ОТ-ПЦР будут проведены с использованием праймеров, специфически распознающих рекомбинированный VDJ-регион цепи TCR Vβ5.
    2. Развитие и созревание Т-клеток. Рисунок 3а.
      1. На 2-й, 4-й и 6-й неделях после переноса клеток животных подвергают эвтаназии, после чего извлекают селезенку и лимфатические узлы.
      2. Суспензия единичных клеток будет получена путем механического разрушения. Эритроциты подвергнут лизису с использованием лизирующего буфера ACK, после чего мононуклеары соберут и дважды промоют в холодном PBS.
      3. После промывки клетки блокируют с помощью Fc-блокера 24G2 в 4 °C в течение 20 минут; по завершении блокировки клетки разделят на аликвоты и окрасят различными антителами, конъюгированными с флуорохромами, в 4 °C в течение 20 минут.
      4. По окончании окрашивания клетки трижды промывают холодным PBS перед загрузкой в проточный цитометр.
    3. Стимуляция пептидами. Рисунок 3b.
      1. На 50-й день после введения опухолевых клеток животных забивают, после чего извлекают селезенку и лимфатические узлы.
      2. Одноклеточная суспензия будет получена путем механического разрушения. Эритроциты подвергнут лизису с использованием лизирующего буфера ACK, после чего мононуклеарные клетки соберут и дважды промоют в холодном PBS.
      3. CD8+ Т-клетки будут изолированы с использованием набора CD8 компании Miltenyi Biotec+ Набор для выделения Т-клеток. Выделенные CD8+ Т-клетки смешивают с облученными спленоцитами, выделенными из наивных мышей линии C57BL/6J, в соотношении 1:10, и подвергают пульсации с 0.5 μmol/ml OVA257-264 пептидом в течение 40 часов. После этого в культуру добавят брефелдин А еще на 4 часа.
      4. По завершении совместного культивирования клетки собирают, промывают и подвергают блокировке с помощью Fc-блокатора, как описано выше.
      5. Блокированные клетки будут окрашены на поверхностные маркеры, такие как CD8 и цепь TCR Vβ5, с использованием конъюгированных с флуорохромом антител.
      6. После окрашивания поверхностных антигенов клеток проведите их фиксацию с помощью 4% формальдегида и пермеабилизацию с использованием набора для пермеабилизации клеток.
      7. После пермеабилизации внутриклеточные молекулы, такие как IL-2 и IFN-γ, окрашивают с помощью антител, конъюгированных с флуорохромами.
      8. Перед окончательным анализом методом проточной цитометрии клетки промывают трижды в холодном PBS для удаления избытка антител.
    4. In vivo анализ цитотоксичности (тест на гибель клеток) Рисунок 3C.
      1. Спленоциты наивных мышей линии C57BL/6J будут выделены и маркированы карбоксифлуоресцеиновым сукцинимидным эфиром (CFSE) в качестве таргетных клеток.
      2. Клетки, меченные 5 μmol/ml CFSE (карбоксифлуоресцеин сукцинимидэфир)Привет клетки) подвергнут воздействию импульса 10 μg/ml овальбумин257-264 пептид и клетки, меченые 0.5 μmol/ml CFSE (карбоксифлуоресцеин сукцинимидэфир)ло клетки) не будут подвергнуты воздействию импульсов.
      3. Смесь из 2,5x106 CFSE (карбоксифлуоресцеин сукцинимилэфир)Здравствуйте клетки плюс 2,5x106 CFSEло клетки будут перенесены путем адаптивного переноса посредством внутривенной инъекции указанному реципиенту.
      4. Через 16 часов у этих мышей будет выделено количество спленоцитов, после чего CFSE+-клетки будут проанализированы методом проточной цитометрии.
    5. Подсчет количества опухолевых клеток в брюшной полости. Рисунок 4.
      На 20-й день после введения опухолевых клеток мышей эвтаназируют и проведут промывание брюшной полости охлажденным PBS. Затем подсчитают количество опухолевых клеток, полученных в результате промывания брюшной полости.
    6. Идентификация опухоль-инфильтрирующих Т-клеток. Рисунок 5.
      1. На поздней стадии опухолевого процесса мышей из разных групп подвергнут эвтаназии, после чего из брюшной полости будет удалена опухоль.
      2. Опухоль следует разрезать на фрагменты: один фрагмент помещают в криопробирку и немедленно переносят на сухой лед, вторую часть фиксируют в формальдегиде, а третий фрагмент сохраняют в кондиционированной среде RPMI-1640 для последующего использования.
      3. H&Окрашивание на E будет выполнено в соответствии с общим протоколом с использованием образцов, фиксированных формальдегидом и залитых парафином.
      4. Иммунофлуоресцентное окрашивание будет проведено на криоконсервированных образцах.
        1. Ткань будет подвергнута секционированию и законсервирована в -20 °C перед использованием.
        2. Срезы тканей подвергнут высушиванию на воздухе в течение 15 минут с последующей 15-минутной фиксацией в холодном ацетоне.
        3. После фиксации срезы высушивают на воздухе еще в течение 15 минут, после чего промывают в PBS в течение 5 минут.
        4. После промывки поместите предметные стекла в увлажненную камеру и нанесите на срез ткани 30 μl 3% раствор BSA в PBS в течение 30 минут для блокирования неспецифического связывания.
        5. По завершении блокировки удалите остатки блокирующего буфера промакиванием и покройте срезы ткани 50 μl смесь антител PE-анти-TCR Vα2 и антител FITC-анти-OVA, разведенных в 3% растворе BSA в PBS.
        6. Инкубируйте в увлажненной камере в течение 2 часов, после чего slides промойте трижды в холодном PBS и закройте водойным заключающим средством перед исследованием с помощью флуоресцентного микроскопа.
      5. Проточная цитометрическая analiza опухоль-инфильтрирующих T-клеток.
        1. Опухоль будет гомогенизирована до состояния суспензии одиночных клеток, после чего эритроциты будут лизированы с помощью лизирующего буфера ACK.
        2. После промывки и блокировки клетки будут маркированы различными антителами, конъюгированными с флуорохромами, которые специфически распознают молекулы CD8, TCR Vα2 и TCR Vβ5, экспрессируемые на поверхности клеток.
    7. Выживаемость мышей. Рисунок 6.
      После введения опухолевых клеток будет вестись тщательный мониторинг выживаемости мышей.

4. Репрезентативные результаты

CD3 и TCRβ используются в качестве маркеров T-клеток. Чтобы определить, может ли стимуляция iPS-клеток лигандом Notch DL1 способствовать дифференцировке T-клеток, мы оценили экспрессию CD3 и TCRβ+ на клетках, полученных из iPS-клеток, и далее проанализировали экспрессию CD4 и CD8, выделив популяцию CD3+ и TCRβ+. Как показано здесь, на 22-й день из iPS-клеток in vitro были получены одинарные положительные (SP) T-клетки CD3+ TCRβ+ CD4- CD8+. Кроме того, SP-клетки, полученные из iPS-клеток, были способны вырабатывать IL-2 и IFN-γ при стимуляции in vitro антителами к CD3, нанесенными на планшет, и растворимыми антителами к CD28 (Рис. 2), что свидетельствует о функциональности T-клеток, полученных из iPS-клеток.

После адаптивного переноса реципиентным мышам большинство iPS-клеток, трансдуцированных геном TCR, дифференцировались в CD8+ CTL, которые реагировали in vitro на пептидную стимуляцию секрецией IL-2 и IFN-γ (Рис. 3). Что наиболее важно, адаптивный перенос iPS-клеток, трансдуцированных TCR, вызвал инфильтрацию OVA-реактивных CTL в ткани опухоли и защитил животных от развития опухоли (Рис. 5-6). Таким образом, iPS-клетки, трансдуцированные геном TCR, могут дифференцироваться в функциональные антигенспецифические CTL in vivo.

Дифференцировка клеток, микроскопические изображения, таймлапс, клеточные культуры, с 0-го по 22-й день, стадии роста.
Рисунок 1. Морфология дифференцировки иПСК. В разные дни иПСК мыши совместно культивировали с клетками OP9-DL1 в среде α-MEM с добавлением 20% FCS и 2,2 g/L бикарбоната натрия в присутствии 5 ng/ml mFlt3L и 1 ng/ml mIL-7.

Проточная цитометрия маркеров TCRβ, CD3, CD4, CD8; гистограммный анализ IL-2, IFN-γ; данные по иммунным клеткам.
Рисунок 2. Дифференцировка Т-клеток из иПСК. Мышиные иПСК совместно культивировали с клетками OP9-DL1, как описано на Рисунке 1. На 22-й день производные иПСК клетки были изолированы и проанализированы. A) Клетки CD4+ CD8- или CD4- CD8+ после гейтирования по популяциям CD3+ и TCRβ+. B) Клетки стимулировали антителами к CD3, нанесенными на поверхность планшета, и растворимыми антителами к CD28 в течение 5 часов при 37 °C и 5% CO2. Анализ экспрессии IL-2 и IFN-γ проводили методом внутриклеточного окрашивания после гейтирования живых Т-клеток CD4- CD8+.

Flow cytometry analysis, CD8 and Vβ5 markers, cell comparison, graph for research studies.
Рисунок 3. Антигенспецифичные CD8+ Дифференцировка Т-клеток из иПСК in vivoБыли введены иПСК, трансдуцированные геном ТCR клеток OT-I. в/в мышам линии C57BL/6. Через шесть-десять недель OVA-специфические CD8+ Vβ5+ Был определен процесс развития Т-клеток. А) CD8+ Vβ5+ Т-клетки из объединенных образцов лимфоузлов и селезенки анализировали методом проточной цитометрии после выделения популяции CD8+ клеток.+ популяций. B) Продукция IL-2 и IFN-γ (темные линии; заштрихованные области обозначают изотипический контроль) определялась методом внутриклеточного окрашивания на цитокины после гейтирования по CD8+ Vβ5+ популяции. C) In vivo анализ пролиферации/цитотоксичности. CFSEЗдравствуйте (правые пики) и CFSEПожалуйста, предоставьте текст для перевода. (левые пики) целевые клетки подвергались электропорации OVA257-264 пептид и контрольный препарат соответственно, и вводились мышам через десять недель после переноса иПК или через один день после переноса ЦТЛ OT-I.

Столбчатая диаграмма, показывающая количество опухолевых клеток; эксперимент с iPS-клетками MiDR-TCR; сравнение методов лечения.
Рисунок 4. Адоптивный перенос iPS-клеток, трансдуцированных геном OT-I TCR, подавляет рост опухоли. iPS-клетки, трансдуцированные геном OT-I TCR, были адоптивно перенесены мышам линии C57BL/6. Одной группе мышей вводили OVA-реактивные CD8+ T-клетки от трансгенных мышей OT-I TCR, а в другой группе перенос клеток не проводился. Через шесть недель или на следующий день после переноса клеток мышам вводили опухолевые клетки E. G7. На 20-й день проводили подсчет опухолевых клеток в брюшной полости.

Эксперимент по клеточной иммунотерапии; результаты микроскопии и проточной цитометрии, иПСК-клетки, анализ TCR.
Рисунок 5. Инфильтрация опухолевых тканей антигенспецифическими CTL, полученными из иПСК. На 30–35 день после введения опухолевых клеток ткани опухоли были исследованы на предмет инфильтрации опухоль-реактивными Т-клетками. A) Окрашивание гематоксилином и эозином (H&E). Инфильтрация воспалительных клеток в опухолевые ткани (↓). B) Иммуногистохимическое окрашивание. OVA-специфические Vα2+ CTL (красный цвет) инфильтрировали опухолевые ткани, экспрессирующие OVA (зеленый цвет). C) Суспензии одиночных клеток из опухолевых тканей были проанализированы методом проточной цитометрии на экспрессию Vα2+ и Vβ5+ после гейтирования по популяции CD8+.

График анализа выживаемости; терапия iPS-клетками; эффекты переноса клеток; анализ зависимости процента выживаемости от количества дней.
Рисунок 6. Адоптивный перенос iPS-клеток, трансдуцированных геном TCR OT-I, поддерживает выживаемость мышей. iPS-клетки, трансдуцированные геном TCR OVA, были адоптивно перенесены мышам линии C57BL/6, которым была проведена индукция опухоли клетками E. G7, как описано на рис. 4. Выживаемость мышей на 50-й день представлена кривыми выживаемости Каплана-Мейера (n=6).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Для терапии на основе адоптивного переноса Т-клеток (ACT) оптимальным подходом является генерация in vitro большого количества высокореактивных Ag-специфических Т-клеток для последующей реинфузии in vivo. Несмотря на то, что наш метод in vitro позволяет получать функциональные Т-клетки из иПСК, большое количество клеток, производных от иПСК, погибает в течение четырех недель, особенно на четвертой неделе. Мы пришли к выводу, что сигналов выживания от Notch-сигналинга, опосредованного DL1, а так...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Конфликт интересов не заявлен.

Благодарности

Мы благодарим доктора Синю Яманаку (Киотский университет) за предоставление клеточной линии iPS-MEF-Ng-20D-17, доктора Дарио Виньяли (Детская исследовательская больница Святого Иуды) за предоставление конструкции OT1-2A•pMig II, доктора Хуана Карлоса Сунигу-Пфлюккера (кафедра иммунологии Университета Торонто) за предоставление клеточной линии OP9-DL1 и доктора Кента Е. Врану (кафедра фармакологии медицинского колледжа Университета штата Пенсильвания) за помощь в планировании данного исследования. Этот проект финансируется в рамках грантов Национального института рака под номером K18CA151798, траста Барсумяна и Фонда исследований меланомы (Дж. Сонг).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Мыши C57BL/6JJackson Laboratory000664
B6.129S7-Rag1tm1Mom/JJackson Laboratory002216
Антитела к CD3 (2C11)BD Biosciences553058
Антитела к CD28 (37.51)BD Biosciences553295
Антитела к CD3 (17A2)BioLegend100202
Антитела к CD4 (GK1.5)BioLegend100417
Антитела к CD8 (53-6.7)BioLegend100714
Антитела к CD25 (3C7)BioLegend101912
Антитела к CD44 (1M7)BioLegend103012
Антитела к CD117 (2B8)BioLegend105812
Антитела к TCR-β (H57597)BioLegend109220
Антитела к IL-2 (JES6-5H4)BioLegend503810
Антитела к IFN-γ (XMG1.2)BioLegend505822
DMEMInvitrogenABCD1234
α-MEMInvitrogenA10490-01
FBSHycloneSH3007.01
Брефелдин ASigma-AldrichB7651
ПолибреноSigma-Aldrich107689
GeneJammerIntegrated Sciences204130
Набор для выделения РНКQiagen74104
Набор для выделения ДНКQiagen69504
Набор для выделения CD8+ клетокMiltenyi Biotec130-095-236
Буфер для лизиса ACKLonza Inc.10-548E
mFlt-3LPeproTech Inc250-31L
mIL-7PeproTech Inc217-17
ЖелатинSigma-AldrichG9391
FITC-антитела к OVARockland Immunochemicals200-4233
Буфер для пермеабилизацииBiolegend421002
BSASigma-AldrichA7906
ФормальдегидSigma-AldrichF8775
Фильтр 0.4 μmEMD Millipore
Сортировщик клеток MofloDako
Проточный цитометр CaliburBD Biosciences
Проточный цитометр LSR IIBD Biosciences
Фиксатор для мышейBraintree Scientific, Inc.

Ссылки

  1. Brenner, M. K., Heslop, H. E. Adoptive T cell therapy of cancer. Curr. Opin. Immunol. 22, 251-257 (2010).
  2. Hataye, J., Moon, J. J., Khoruts, A., Reilly, C., Jenkins, M. K. Naive and memory CD4+ T cell survival controlled by clonal abundance. Science. 312, 114-116 (2006).
  3. Seki, Y. IL-7/STAT5 cytokine signaling pathway is essential but insufficient for maintenance of naive CD4 T cell survival in peripheral lymphoid organs. J. Immunol. 178, 262-270 (2007).
  4. Stemberger, C. A single naive CD8+ T cell precursor can develop into diverse effector and memory subsets. Immunity. 27, 985-997 (2007).
  5. Siewert, C. Experience-driven development: effector/memory-like alphaE+Foxp3+ regulatory T cells originate from both naive T cells and naturally occurring naive-like regulatory T cells. J. Immunol. 180, 146-155 (2008).
  6. Wang, L. X., Plautz, G. E. Tumor-primed, in vitro-activated CD4+ effector T cells establish long-term memory without exogenous cytokine support or ongoing antigen exposure. J. Immunol. 184, 5612-5618 (2010).
  7. Hinrichs, C. S. Human effector CD8+ T cells derived from naive rather than memory subsets possess superior traits for adoptive immunotherapy. Blood. 117, 808-814 (2011).
  8. Alajez, N. M., Schmielau, J., Alter, M. D., Cascio, M., Finn, O. J. Therapeutic potential of a tumor-specific, MHC-unrestricted T-cell receptor expressed on effector cells of the innate and the adaptive immune system through bone marrow transduction and immune reconstitution. Blood. 105, 4583-4589 (2005).
  9. Yang, L., Baltimore, D. Long-term in vivo provision of antigen-specific T cell immunity by programming hematopoietic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 4518-4523 (2005).
  10. Zhao, Y. Extrathymic generation of tumor-specific T cells from genetically engineered human hematopoietic stem cells via Notch signaling. Cancer Res. 67, 2425-2429 (2007).
  11. Boztug, K. Stem-cell gene therapy for the Wiskott-Aldrich syndrome. N. Engl. J. Med. Med, N. .E. ngl.J. . 363, 1918-1927 (2010).
  12. Peerani, R., Zandstra, P. W. Enabling stem cell therapies through synthetic stem cell-niche engineering. J. Clin. Invest. 120, 60-70 (2010).
  13. Mendez-Ferrer, S. Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche. Nature. 466, 829-834 (2010).
  14. Daley, G. Q. Towards the generation of patient-specific pluripotent stem cells for combined gene and cell therapy of hematologic disorders. Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program. , 17-22 (2007).
  15. Boitano, A. E. Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells. Science. 329, 1345-1348 (2010).
  16. Himburg, H. A. Pleiotrophin regulates the expansion and regeneration of hematopoietic stem cells. Nat. Med. 16, 475-482 (2010).
  17. Tanigaki, K., Honjo, T. Regulation of lymphocyte development by Notch signaling. Nature immunology. 8, 451-456 (2007).
  18. Zhao, T., Zhang, Z. N., Rong, Z., Xu, Y. Immunogenicity of induced pluripotent stem cells. Nature. 474, 212-215 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Дифференцировка Т-лимфоцитовстимуляция лигандом Notchтрансдукция генов TCRпроточная цитометриякультуральная система OP9 DL1модель мышей с дефицитом Ragантигенспецифические ЦТЛанализ опухолевого challenge-теставнутриклеточное окрашивание цитокинов
Направленной дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток по отношению к Т-лимфоцитов
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.