Направленной дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток по отношению к Т-лимфоцитов

Краткое содержание

Получение T-лимфоцитов из индуцированных плюрипотентных стволовых (иПС) клеток представляет собой альтернативный подход использованию эмбриональных стволовых клеток для T-клеточной иммунотерапии. Данный метод демонстрирует, что при использовании систем индукции in vitro или in vivo иПС-клетки способны дифференцироваться как в конвенциональные, так и в антигенспецифические T-лимфоциты.

Аннотация

Адоптивный перенос клеток (ACT) антигенспецифических CD8⁺ цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) является перспективным методом лечения различных злокачественных новообразований ¹. ЦТЛ способны распознавать злокачественные клетки путем взаимодействия опухолевых антигенов с Т-клеточными рецепторами (TCR), после чего высвобождают цитотоксины и цитокины для уничтожения этих клеток. Известно, что наименее дифференцированные ЦТЛ и ЦТЛ с фенотипом центральной памяти (определяемые как высокореактивные) являются оптимальной популяцией для иммунотерапии на основе ACT, поскольку такие ЦТЛ обладают высоким пролиферативным потенциалом, менее склонны к апоптозу, чем более дифференцированные клетки, и имеют более высокую способность отвечать на гомеостатические цитокины ^2-7. Однако в связи с трудностями получения большого количества таких ЦТЛ от пациентов существует острая необходимость в поиске нового подхода к генерации высокореактивных Ag-специфических ЦТЛ для успешного проведения терапии на основе ACT.

Трансдукция TCR в самообновляющиеся стволовые клетки для иммунной реконституции обладает терапевтическим потенциалом для лечения заболеваний ^8-10. Однако подход, основанный на получении эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) от пациентов, неосуществим. Хотя использование гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) в терапевтических целях широко применяется в клинике ^11-13, ГСК обладают сниженной дифференцировочной и пролиферативной способностью, а их экспансия в культуре клеток in vitro затруднена ^14-16. Современная технология получения иПСК и разработка системы доставки генов in vitro позволяют генерировать иПСК от пациентов без какого-либо хирургического вмешательства. Кроме того, подобно ЭСК, иПСК обладают неограниченной пролиферативной способностью in vitro, и было показано, что они способны дифференцироваться в гемопоэтические клетки. Таким образом, иПСК обладают более высоким потенциалом для использования в иммунотерапии на основе ACT по сравнению с ЭСК или ГСК.

В данной работе мы представляем методы получения T-лимфоцитов из иПСК in vitro, а также программирование антигенспецифических ЦТЛ из иПСК in vivo для усиления иммунного надзора при раке. Стимуляция in vitro лигандом Notch индуцирует дифференцировку Т-клеток из иПСК, а трансдукция гена TCR приводит к дифференцировке иПСК в антигенспецифические Т-клетки in vivo, что предотвращает рост опухоли. Таким образом, мы демонстрируем дифференцировку иПСК в антигенспецифические Т-клетки. Наши исследования предлагают потенциально более эффективный подход к получению антигенспецифических ЦТЛ для терапии на основе адоптивного переноса Т-клеток (ACT) и способствуют разработке терапевтических стратегий лечения заболеваний.

Протокол

1. Культура клеток

1. Подготовка облученных фидерных клеток SNL76/7 (irSNL76/7) для культивирования.
   Клетки SNL76/7 обычно поддерживают в среде DMEM (модифицированная Дульбекко среда Игла), содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS).
   1. Чашку или флакон для культивирования покрывают 0,1% раствором желатина при 37 °C в инкубаторе в течение 30 минут перед извлечением клеток SNL76/7 из жидкого азота.
   2. При достижении клетками SNL76/7 конфлюэнтности их отделяют трипсинизацией, центрифугируют при 400 g в течение 5 мин и ресуспендируют в свежей среде.
   3. Ресуспендированные клетки SNL76/7 облучают в иррадиаторе ⁶⁰Co дозой 5000 Rads.
      В качестве альтернативного подхода клетки SNL76/7 можно заменить эмбриональными фибробластами мыши (MEF), а облучение — инактивацией митомицином.
   4. После облучения клетки центрифугируют при 400 g в течение 5 мин, ресуспендируют в буфере для замораживания, состоящем из 10% диметилсульфоксида (DMSO) и FBS, разливают по криопробиркам и хранят в жидком азоте для дальнейшего использования.
2. Подготовка клеток OP9-DL1 для дифференцировки in vitro.
   Клетки OP9-DL1 обычно поддерживают в среде α-MEM (минимальная эссенциальная среда α), содержащей 20% FBS. При достижении конфлюэнтности клетки пересевают в разведении 1:5.
3. Подготовка клеток тимомы E.G7.
   Клетки тимомы E.G7 обычно поддерживают в среде RPMI-1640 (среда Института памяти Розуэлла Парка), содержащей 10% FBS. При достижении конфлюэнтности клетки пересевают в разведении 1:10.
4. Общее содержание иPS-клеток и TCR-трансдуцированных иPS-клеток.
   1. Чашку для культивирования покрывают 0,1% раствором желатина при 37 °C в течение 30 минут перед высевом фидерных клеток irSNL76/7 за один день до восстановления или пассирования иPS-клеток.
   2. Для пассирования иPS-клеток их отделяют трипсинизацией, центрифугируют при 400 g в течение 5 мин и ресуспендируют в среде DMEM с 15% FBS.
   3. Трипсинизированные иPS-клетки инкубируют в чистой чашке для культивирования в течение 30 минут в инкубаторе при 37 °C перед высевом на свежую чашку с предварительно нанесенным слоем фидерных клеток irSNL76/7, чтобы исключить дифференцированные клетки и остатки фидерных клеток.
   4. После инкубации 4×10⁶ клеток высевают в чашку для культивирования диаметром 100 мм.

2. Программирование in vitro

1. Система кокультивирования in vitro.
   1. В день 0 5x10⁴ иПСК высеивают в чашку Петри диаметром 100 мм, содержащую конфлюэнтный монослой клеток OP9-DL1 в среде α-MEM с 20% FBS.
   2. На 3-й день культуральную среду заменяют на свежую.
   3. 1. На 5-й день клетки отделяют трипсином и центрифугируют при 400 g в течение 5 мин, после чего инкубируют в новой чашке Петри диаметром 100 мм в течение 30 минут в инкубаторе при 37 °C.
      2. Взвешенные клетки собирают и подсчитывают; 5x10⁵ клеток переносят в новую чашку Петри, содержащую конфлюэнтный монослой клеток OP9-DL1 в среде α-MEM с 20% FBS. В культуру добавляют цитокин mFlt-3L (конечная концентрация: 5 ng/mL).
   4. 1. На 8-й день слабо прикрепившиеся клетки осторожно осаждают с помощью пипетки.
      2. Подпитывающий слой OP9-DL1 промывают 10 mL PBS еще один раз для обеспечения максимального выхода частично дифференцированных иПСК.
      3. После сбора клеток из кокультуры их центрифугируют при 400 g в течение 5 мин и ресуспендируют в среде α-MEM с 20% FBS, дополненной mFlt-3L (5 ng/mL) и mIL-7 (1 ng/mL).
      4. Клетки переносят в 6-луночный планшет для культивирования, покрытый конфлюэнтными клетками OP9-DL1. Обычно иПСК, полученные из одной чашки Петри диаметром 100 мм, переносят в одну лунку 6-луночного планшета.
   5. 1. Начиная с 10-го дня, культуральную среду заменяют через день (среда α-MEM с 20% FBS, дополненная mFlt-3L (5 ng/mL) и mIL-7 (1 ng/mL)).
      2. Планшеты с фидерными клетками OP9-DL1 заменяют каждые 4–6 дней в зависимости от роста фидерных клеток.
2. Созревание частично дифференцированных иПСК in vivo.
   1. На 22-й день кокультивирования иПСК отделяют трипсином, центрифугируют при 400 g в течение 5 мин и инкубируют в новой чашке для культивирования при 37 °C в течение 30 минут.
   2. Взвешенные клетки собирают, пропускают через нейлоновый фильтр с порами 70 μm для удаления клеточных агрегатов, которые могут вызвать тромбоэмболию легочной артерии у мышей, и трижды промывают холодным PBS.
   3. Клетки ресуспендируют в PBS до концентрации 1.5x10⁷ клеток/mL.
   4. Перед инъекцией клетки выдерживают на льду.
   5. Перед внутривенным (i.v.) введением в хвостовую вену мышей помещают под инфракрасную лампу для расширения вены хвоста.
   6. После расширения вены 200 μl клеточной суспензии или 3x10⁶ клеток адаптивно переносят 4-недельной мыши линии B6.129S7-Rag1^tm1Mom/J через хвостовую вену. Для созревания частично дифференцированных иПСК in vivo выжидают три недели.
3. Оценка.
   1. Морфологические изменения дифференцированных клеток и степень восстановления клеток. Рисунок 1.
      1. На разные дни кокультивирования с клетками OP9-DL1 делают снимки живых клеток с помощью обычного микроскопа.
      2. Степень восстановления клеток рассчитывают на основе количества клеток, собранных из культуры.
   2. Проточный цитометрический анализ изменений поверхностных маркеров. Рисунок 2a.
      1. На разные дни кокультивирования клетки удаляют из культуры путем трипсинизации и промывают холодным PBS перед окрашиванием поверхности клеток.
      2. Перед окрашиванием антителами, конъюгированными с различными флуорохромами, клетки блокируют Fc-блокатором 24G2 при 4 °C в течение 20 минут.
      3. После 20-минутного окрашивания при 4 °C клетки трижды промывают холодным PBS перед проведением проточного цитометрического анализа.
   3. Активация иПСК, дифференцированных in vitro. Рисунок 2b.
      1. За один день до теста на активацию 24-луночный планшет предварительно покрывают анти-CD3 (конечная концентрация: 4 μg/mL в PBS) при 4 °C в течение ночи.
      2. На 22-й день кокультивирования Т-клетки, полученные из иПСК, собирают из культуры и промывают холодным PBS перед стимуляцией анти-CD3, нанесенными на планшет, и растворимыми антителами анти-CD28 (конечная концентрация: 4 μg/mL).
      3. Инкубацию проводят в инкубаторе при 37 °C и 5% CO₂ в течение 40 часов, после чего в культуру добавляют бефилдин А еще на 4 часа.
      4. По окончании кокультивирования клетки собирают, промывают и блокируют Fc-блокатором, как описано выше. Заблокированные клетки окрашивают на поверхностные маркеры, такие как CD8 и Vβ-цепь TCR, используя антитела, конъюгированные с флуорохромами.
      5. После окрашивания поверхности клетки фиксируют 4% формальдегидом и пермеабилизируют с помощью набора для пермеабилизации Biolegend.
      6. После пермеабилизации внутриклеточные молекулы, такие как IL-2 и IFN-γ, окрашивают антителами, конъюгированными с флуорохромами.
      7. Перед окончательным проточным цитометрическим анализом клетки трижды промывают холодным PBS для удаления избытка антител.
   4. Созревание у мышей Rag-/-.
      1. После трех недель развития in vivo мышей Rag-/- усыпляют, извлекают селезенку и лимфатические узлы.
      2. Одиночные клетки получают путем механического разрушения тканей. Эритроциты лизируют с помощью буфера для лизиса ACK, затем собирают мононуклеары и дважды промывают их холодным PBS.
      3. После промывки клетки блокируют Fc-блокатором 24G2 при 4 °C в течение 20 минут, после чего окрашивают различными конъюгированными с флуорохромами антителами анти-CD3, анти-CD4, анти-CD8 и анти-TCRβ при 4 °C в течение 20 минут.
      4. По окончании окрашивания клетки трижды промывают холодным PBS перед проведением проточного цитометрического анализа.

3. Программирование in vivo

1. Создание ретровирусной конструкции.
   1. Вектор MSCV-IRES-DsRED (MiDR) сконструирован на основе вектора MSCV-IRES-GFP путем замены гена GFP геном DsRED.
   2. Ген рецептора T-клеток OT-I субклонируют в вектор MiDR для создания конструкции OT-I/MiDR.
2. Ретровирусная трансдукция и сортировка клеток.
   1. Клетки упаковки Plat-E используются для получения псевдовирусов, которые будут применяться для последующей трансдукции.
      1. 3x10⁶ Клетки Plat-E высевают в чашку для культивирования диаметром 100 мм за один день до трансфекции.
   2. В день 0 клетки Plat-E будут трансфицированы плазмидой OT-I MiDR с использованием реагента для трансфекции GeneJamma.
   3. В 1-й день 1x10⁶ Клетки иПСК высеют в одну лунку 24-луночного планшета, предварительно покрытого 0,1% желатином.
   4. 1. На второй день супернатант, содержащий псевдовирусы, будет собран из культуры Plat-E и пропущен через фильтр с порами 0,4 мкм для удаления потенциальных загрязнений.
      2. Трансдукцию проведут при температуре 32 °C, центрифугируя при 1400 об/мин в течение 1 часа в присутствии полибрена в концентрации 5 мкг/мл.
      3. После трансдукции с использованием центрифугирования клетки помещают в условия 32 °C и 5% CO2₂ инкубатор на ночь.
   5. На 3-й день повторите процедуру трансдукции, описанную для 2-го дня. Планшет на 6 лунок будет предварительно засеян фидерными клетками irSNL76/7 для последующего использования.
   6. На 4-й день трансдуцированные иПСК трипсинизируют, центрифугируют при 400 g в течение 5 мин и высевают на предварительно подготовленные фидерные клетки irSNL76/7.
   7. При достижении конфлюэнтности клетки подвергают трипсинизации, центрифугируют при 400 g в течение 5 мин и подготавливают к сортингу. Клетки, имеющие двойную экспрессию GFP и DsRED, выделяют с помощью клеточного сортера MoFlo. Отсортированные клетки культивируют на фидерных клетках irSNL76/7 для дальнейшего использования.
3. Адоптивный перенос и введение опухолевых клеток.
   Клетки иПСК, трансдуцированные TCR OT-I (OT-I/iПСК), обычно культивируют на фидерных клетках irSNL76/7, как описано выше.
   1. В день адаптивного переноса клетки OT-I/iPS отделяют с помощью трипсина, центрифугируют при 400 g в течение 5 минут и ресуспендируют в свежей среде.
   2. Требуется инкубация в течение 30 минут в инкубаторе при 37 °C в чашке с новой культурой для удаления дифференцированных клеток и остаточных фидерных клеток.
   3. По окончании инкубации следует собрать плавающие клетки и центрифугировать их при 400 g в течение 5 мин.
   4. Осадок клеток трижды промывают холодным раствором PBS, при этом между двумя промывками клетки пропускают через нейлоновый фильтр с размером пор 70 мкм для удаления клеточных агрегатов (двойная фильтрация).
   5. После промывки клетки подсчитывают и ресуспендируют в холодном PBS до концентрации 1,5x10⁶.⁷ кл/мл
   6. Перед введением клетки следует хранить на льду.
   7. Для адаптивного переноса будут использованы самки мышей линии C57BL/6J в возрасте 4–6 недель. Перед в.в. для инъекции в хвостовую вену мышей помещают под инфракрасную лампу для расширения хвостовых вен.
   8. После расширения вены вводят 200 мкл клеточной суспензии или 3x10⁶ клетки будут введены путем адаптивного переноса через хвостовую вену. Далее будет выдержана пауза в шесть недель для in vivo созревание индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, трансдуцированных TCR мышей линии OT-I.
   9. 1. Спустя шесть недель в/в инъекция, 4x10⁶ Клетки тимомы E.G7 будут введены путем внутрибрюшинной инокуляции.
      2. Клетки тимомы E.G7 собирают из культуры и промывают трижды в PBS.
      3. По окончании промывки клетки будут суспендированы в холодном PBS в концентрации 8x10^6.⁷ клеток/мл.
      4. 50 мкл клеточной суспензии или 4x10⁶ клетки будут введены в брюшную полость.
4. Оценка.
   1. In vitro характеристика иПСК, трансдуцированных TCR мышей линии OT-I.
      1. Флуоресцентная микроскопия клеток, дважды положительных по DsRED и GFP, будет проводиться с использованием обычного флуоресцентного микроскопа на нефиксированных живых клетках.
      2. Интеграция и экспрессия гена будут проанализированы с помощью ПЦР и ОТ-ПЦР.
         1. Клеточную ДНК или РНК будут изолировать из образцов по отдельности с использованием набора для выделения ДНК или РНК компании Qiagen.
         2. ПЦР и ОТ-ПЦР будут проведены с использованием праймеров, специфически распознающих рекомбинированную область VDJ цепи TCR Vβ5.
   2. Развитие и созревание Т-клеток. Рисунок 3a.
      1. На 2-й, 4-й и 6-й неделе после переноса клеток животные будут подвергнуты эвтаназии, после чего у них будут извлечены селезенка и лимфатические узлы.
      2. Одноклеточная суспензия будет получена путем механического разрушения ткани. Эритроциты подвергнут лизису с использованием лизирующего буфера ACK, после чего мононуклеарные клетки соберут и дважды промоют в холодном PBS.
      3. После промывки клетки инкубируют с Fc-блокатором 24G2 при 4 °C в течение 20 минут; по окончании блокировки клетки разделяют на аликвоты и окрашивают антителами, конъюгированными с различными флуорохромами, при 4 °C в течение 20 минут.
      4. По завершении окрашивания клетки трижды промывают холодным фосфатно-солевым буфером (PBS) перед нанесением на проточный цитометр.
   3. Пептидная стимуляция. Рисунок 3b.
      1. На 50-й день после введения опухолевых клеток животных подвергнут эвтаназии, после чего извлекут селезенку и лимфатические узлы.
      2. Одноклеточная суспензия будет получена путем механического разрушения. Эритроциты будут лизированы с использованием лизирующего буфера ACK, после чего мононуклеары будут собраны и дважды промыты холодным PBS.
      3. CD8⁺ Т-клетки будут выделены с использованием набора CD8 компании Miltenyi Biotec.⁺ Набор для выделения Т-клеток. Выделенные CD8+ Т-клетки смешивают с облученными спленоцитами, выделенными из наивных мышей линии C57BL/6J, в соотношении 1:10 и подвергают пульсации 0,5 мкмоль/мл OVA_257-264 пептид в течение 40 часов. После этого в культуру добавят брефелдин А еще на 4 часа.
      4. По завершении совместного культивирования клетки собирают, промывают и блокируют Fc-блокатором, как описано выше.
      5. Заблокированные клетки будут окрашены на поверхностные маркеры, такие как CD8 и цепь TCR Vβ5, с использованием конъюгированных с флуорохромами антител.
      6. После окрашивания поверхности клеток их фиксируют 4% формальдегидом и подвергают пермеабилизации с помощью набора для пермеабилизации клеток.
      7. После пермеабилизации внутриклеточные молекулы, такие как IL-2 и IFN-γ, окрашивают с помощью антител, конъюгированных с флуорохромом.
      8. Перед окончательным анализом методом проточной цитометрии клетки промывают трижды в холодном PBS для удаления избытка антител.
   4. In vivo анализ цитотоксичности (тест на гибель клеток) Рисунок 3C.
      1. Спленоциты мышей линии C57BL/6J (наивных) будут выделены и маркированы карбоксифлуоресцеин-сукцинимидным эфиром (CFSE) для использования в качестве клеток-мишеней.
      2. Клетки, меченые CFSE в концентрации 5 мкмоль/мл (CFSE^{Здравствуйте} клетки) будут стимулированы OVA в концентрации 10 мкг/мл_257-264 пептид и клетки, меченные 0,5 мкмоль/мл CFSE (CFSE^ло клетки) не будут подвергаться воздействию импульсов.
      3. Смесь 2,5x10⁶ CFSE^{Здравствуйте} клетки плюс 2,5x10⁶ CFSE (карбоксифлуоресцеин сукцинимидэфир)^ло клетки будут перенесены путем адаптивного переноса посредством внутривенной инъекции указанному реципиенту.
      4. Через 16 часов из этих мышей будут выделены спленоциты, после чего CFSE+ клетки будут проанализированы с помощью проточной цитометрии.
   5. Подсчет количества опухолевых клеток в брюшной полости. Рисунок 4.
      На 20-й день после введения опухолевых клеток мышей усыпляют и проводят промывание брюшной полости холодным раствором PBS. Полученные в результате промывания опухолевые клетки подсчитывают.
   6. Идентификация Т-клеток, инфильтрирующих опухоль. Рисунок 5.
      1. На поздней стадии опухолевого воздействия мышей подвергнут эвтаназии и удалят опухоли из брюшной полости у животных из разных групп.
      2. Опухоль разделяют на фрагменты; один фрагмент помещают в криопробирку и немедленно переносят на сухой лед, вторую половину фиксируют в формальдегиде, а третий фрагмент сохраняют в кондиционированной среде RPMI-1640 для последующего использования.
      3. H&Окрашивание на E будет выполнено в соответствии с общим протоколом с использованием образцов, фиксированных формальдегидом и залитых парафином.
      4. Иммунофлуоресцентное окрашивание будет проведено на криоконсервированных образцах.
         1. Ткань будет нарезана на срезы и сохранена при температуре -20 °C до использования.
         2. Срезы тканей подвергнут высушиванию на воздухе в течение 15 минут, после чего проведут фиксацию холодным ацетоном в течение 15 минут.
         3. После фиксации срезы высушивают на воздухе еще в течение 15 минут, после чего промывают в PBS в течение 5 минут.
         4. После промывки поместите предметные стекла в увлажненную камеру и нанесите на срез ткани 30 мкл 3% раствора BSA в PBS на 30 минут для блокирования неспецифического связывания.
         5. По окончании блокировки удалите остатки блокирующего буфера с помощью фильтровальной бумаги и нанесите на срезы ткани 50 мкл смеси антител PE-anti-TCR Vα2 и антител FITC-anti-OVA, разведенных в 3% растворе BSA в PBS.
         6. Инкубируйте в увлажненной камере в течение 2 часов, после чего объектные стекла трижды промойте холодным фосфатно-солевым буфером (PBS) и закройте водойным закрепляющим средством перед исследованием с помощью флуоресцентной микроскопии.
      5. Проточный цитометрический анализ опухоль-инфильтрирующих Т-клеток.
         1. Опухоль будет гомогенизирована до получения суспензии из отдельных клеток, после чего эритроциты будут подвергнуты лизису с использованием лизирующего буфера ACK.
         2. После промывки и блокирования клетки будут помечены различными антителами, конъюгированными с флуорохромами, которые специфически распознают молекулы CD8, TCR Vα2 и TCR Vβ5, экспрессируемые на поверхности клеток.
   7. Выживаемость мышей. Рисунок 6.
      После введения опухолевых клеток будет проводиться тщательный мониторинг выживаемости мышей.

4. Репрезентативные результаты

CD3 и TCRβ используются в качестве маркеров T-клеток. Чтобы определить, может ли стимуляция iPS-клеток лигандом Notch DL1 способствовать дифференцировке T-клеток, мы оценили экспрессию CD3 и TCRβ⁺ на клетках, производных от iPS-клеток, и далее проанализировали экспрессию CD4 и CD8, используя гейтирование по популяции CD3⁺ и TCRβ⁺. Как показано здесь, на 22-й день из iPS-клеток in vitro были получены CD3⁺ TCRβ⁺ CD4^- CD8⁺ одноположительные (SP) T-клетки. Кроме того, полученные из iPS-клеток SP-клетки были способны вырабатывать IL-2 и IFN-γ при стимуляции in vitro антителами к CD3, нанесенными на планшет, и растворимыми антителами к CD28 (Рис. 2), что свидетельствует о функциональности полученных из iPS-клеток T-клеток.

После адаптивного переноса реципиентам-мышам большинство иПСК, трансдуцированных геном TCR, дифференцировались в CD8⁺ ЦТЛ, которые реагировали in vitro на стимуляцию пептидом путем секреции IL-2 и IFN-γ (Рис. 3). Что наиболее важно, адаптивный перенос трансдуцированных TCR иПСК вызывал инфильтрацию OVA-реактивных ЦТЛ в ткани опухоли и защищал животных от опухолевого воздействия (Рис. 5-6). Таким образом, иПСК, трансдуцированные геном TCR, могут дифференцироваться в функциональные антигенспецифические ЦТЛ in vivo.

Рисунок 1. Морфология дифференцировки иПСК. В разные дни иПСК мыши совместно культивировали с клетками OP9-DL1 в среде α-MEM с добавлением 20% FCS и 2.2 g/L бикарбоната натрия в присутствии 5 ng/ml mFlt3L и 1 ng/ml mIL-7.

Рисунок 2. Дифференцировка Т-клеток из иПСК. Мышиные иПСК культивировали совместно с клетками OP9-DL1, как описано на Рисунке 1. На 22-й день клетки, производные от иПСК, выделяли и анализировали. A) Клетки CD4⁺ CD8^- или CD4^- CD8⁺ после выделения популяций CD3⁺ и TCRβ⁺. B) Клетки стимулировали анти-CD3 антителами, нанесенными на планшет, и растворимыми анти-CD28 антителами в течение 5 часов при 37 °C и 5% CO₂. Анализ IL-2 и IFN-γ проводили методом внутриклеточного окрашивания после выделения живых Т-клеток CD4^- CD8⁺.

Рисунок 3. Развитие антигенспецифических CD8⁺ Т-клеток из iPS-клеток in vivo. iPS-клетки, трансдуцированные геном TCR OT-I, вводили i.v. мышам линии C57BL/6. Через шесть-десять недель определяли развитие OVA-специфических CD8⁺ Vβ5⁺ Т-клеток. A) Т-клетки CD8⁺ Vβ5⁺ из объединенных лимфатических узлов и селезенки анализировали методом проточной цитометрии после выделения популяции CD8⁺. B) Продукцию IL-2 и IFN-γ (темные линии; закрашенные области обозначают изотипический контроль) определяли с помощью внутриклеточного окрашивания на цитокины после выделения популяций CD8⁺ Vβ5⁺. C) Анализ пролиферации/цитотоксичности in vivo. Таргетные клетки CFSE^hi (правые пики) и CFSE^lo (левые пики) подвергали пульсированию пептидом OVA_257-264 и контролем соответственно, после чего вводили мышам через десять недель после переноса iPS-клеток или через один день после переноса CTL OT-I.

Рисунок 4. Адоптивный перенос iPS-клеток, трансдуцированных геном OT-I TCR, подавляет рост опухоли. iPS-клетки, трансдуцированные геном OT-I TCR, были адоптивно перенесены мышам C57BL/6. Одной группе мышей вводили OVA-реактивные CD8⁺ T-клетки от трансгенных мышей OT-I TCR, а в другой группе перенос клеток не проводился. Через шесть недель или на следующий день после переноса клеток мышам вводили опухолевые клетки E. G7. На 20-й день проводили подсчет опухолевых клеток в брюшной полости.

Рисунок 5. Инфильтрация опухолевых тканей антигенспецифическими CTL, полученными из иПСК. На 30–35 день после введения опухолевых клеток ткани опухоли были исследованы на наличие инфильтрации опухоль-реактивных Т-клеток. A) Окрашивание гематоксилином и эозином (H&E). Инфильтрация воспалительных клеток в ткани опухоли (↓). B) Иммуногистохимическое окрашивание. OVA-специфические Vα2⁺ CTL (красный цвет) инфильтрировали экспрессирующие OVA ткани опухоли (зеленый цвет). C) Суспензии одиночных клеток из тканей опухоли были проанализированы методом проточной цитометрии на экспрессию Vα2⁺ и Vβ5⁺ после гейтирования по популяции CD8⁺.

Рисунок 6. Адоптивный перенос iPS-клеток, трансдуцированных геном TCR OT-I, поддерживает выживаемость мышей. iPS-клетки, трансдуцированные геном TCR OVA, были адоптивно перенесены мышам линии C57BL/6, подвергнутым воздействию опухолевых клеток E. G7, как описано на рис. 4. Выживаемость мышей на 50-й день представлена кривыми выживаемости Каплана-Мейера (n=6).

Обсуждение

Для терапии на основе адоптивного переноса Т-клеток (ACT) оптимальным подходом является генерация in vitro большого количества высокореактивных Ag-специфических Т-клеток для последующей реинфузии in vivo. Несмотря на то, что наш метод in vitro позволяет получать функциональные Т-клетки из иПСК, большое количество клеток, производных от иПСК, погибает в течение четырех недель, особенно на четвертой неделе. Мы пришли к выводу, что сигналов выживания от Notch-сигналинга, опосредованного DL1, а так...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Мыши C57BL/6J	Jackson Laboratory	000664
B6.129S7-Rag1tm1Mom/J	Jackson Laboratory	002216
Антитела к CD3 (2C11)	BD Biosciences	553058
Антитела к CD28 (37.51)	BD Biosciences	553295
Антитела к CD3 (17A2)	BioLegend	100202
Антитела к CD4 (GK1.5)	BioLegend	100417
Антитела к CD8 (53-6.7)	BioLegend	100714
Антитела к CD25 (3C7)	BioLegend	101912
Антитела к CD44 (1M7)	BioLegend	103012
Антитела к CD117 (2B8)	BioLegend	105812
Антитела к TCR-β (H57597)	BioLegend	109220
Антитела к IL-2 (JES6-5H4)	BioLegend	503810
Антитела к IFN-γ (XMG1.2)	BioLegend	505822
DMEM	Invitrogen	ABCD1234
α-MEM	Invitrogen	A10490-01
FBS	Hyclone	SH3007.01
Брефелдин A	Sigma-Aldrich	B7651
Полибрено	Sigma-Aldrich	107689
GeneJammer	Integrated Sciences	204130
Набор для выделения РНК	Qiagen	74104
Набор для выделения ДНК	Qiagen	69504
Набор для выделения CD8+ клеток	Miltenyi Biotec	130-095-236
Буфер для лизиса ACK	Lonza Inc.	10-548E
mFlt-3L	PeproTech Inc	250-31L
mIL-7	PeproTech Inc	217-17
Желатин	Sigma-Aldrich	G9391
FITC-антитела к OVA	Rockland Immunochemicals	200-4233
Буфер для пермеабилизации	Biolegend	421002
BSA	Sigma-Aldrich	A7906
Формальдегид	Sigma-Aldrich	F8775
Фильтр 0.4 μm	EMD Millipore
Сортировщик клеток Moflo	Dako
Проточный цитометр Calibur	BD Biosciences
Проточный цитометр LSR II	BD Biosciences
Фиксатор для мышей	Braintree Scientific, Inc.