Методическая статья

Α-тест: Быстрая бесклеточной CD4 Перечисление Использование Всего слюны

12.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/3999

⸱

16 мая 2012 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, Weill Cornell Medical College , 2Department of Oral Biology, University of Missouri-Kansas City-School of Dentistry, 3Department of Pharmacology and Toxicology, University of Missouri Kansas City- School of Pharmacy, 4Regional Hospital, Bamenda, NWP, Cameroon, 5Mezam Polyclinic HIV/AIDS Treatment Center, Cameroon, 6Institute for Human Genetics and Biochemistry

В этой статье

Краткое содержание

Метод CD4 перечисления, α-тест, описывается, который использует весь слюны обеспечивает быстрое и точное число лимфоцитов CD4. Α-тест расходы копейки и устраняет необходимость в технической подготовке, дорогостоящих реагентов, таких как моноклональные антитела, оборудование, холодильная техника, транспорт образцов, а также сбора и обработки крови.

Аннотация

Существует острая необходимость в доступных методах подсчета CD4 для мониторинга ВИЧ-инфекции. В регионах с ограниченными ресурсами определение количества CD4 недоступно из-за временных и температурных ограничений, технической сложности и стоимости реагентов, в частности моноклональных антител для измерения CD4 на клетках крови, что на данный момент является единственным приемлемым методом. Распространенной лабораторной стратегией экономии средств и времени является расчет, а не прямое измерение определенных показателей крови. Например, уровни LDL рассчитываются на основе измеренных уровней общего холестерина, HDL и триглицеридов1. Таким образом, идентификация бесклеточных коррелятов, которые напрямую регулируют количество CD4+ T-клеток, может обеспечить точный метод расчета количества CD4 благодаря физиологической значимости этих коррелятов.

Количество стволовых клеток, которые попадают в кровь и в дальнейшем становятся циркулирующими CD4+ T-клетками, определяется хемокином CXCL12 и его рецептором CXCR4 благодаря их влиянию на локомоцию2. Процесс локомоции стволовых клеток в кровь дополнительно регулируется поверхностной эластазой лейкоцитов человека (HLECS) и реагирующим на HLECS активным α1протеиназным ингибитором (α1PI, α1антитрипсин, SerpinA1)3. При ВИЧ-1-инфекции α1PI инактивируется вследствие патологических процессов 4. Было обнаружено, что на ранних бессимптомных стадиях ВИЧ-1-инфекции уровень активного α1PI был ниже нормы у 100% нелеченных пациентов с ВИЧ-1 (медиана=12 μM), при этом нормальные уровни достигались на симптоматических стадиях4, 5. Эта закономерность была приписана иммунной инактивации, а не недостаточному синтезу, протеолитической инактивации или оксигенации. Мы заметили, что у субъектов с ВИЧ-1 и количеством CD4-клеток >220 cells/μl число CD4-клеток коррелировало с уровнями активного α1PI в сыворотке (r2=0.93, p<0.0001, n=26) и неактивного α1PI (r2=0.91, p<0.0001, n=26) 5. Введение α1PI инфицированным ВИЧ-1 и неинфицированным субъектам привело к резкому увеличению количества CD4-клеток, что свидетельствует об участии α1PI в регуляции числа CD4+ T-клеток в крови 3.

При стимуляции цельная слюна содержит достаточное количество серозного экссудата (плазмы, содержащей белковый материал, который проходит через стенки кровеносных сосудов в слюну), что позволяет измерить уровень активного α1PI, а корреляция этого измерения служит доказательством того, что данный метод является точным для расчета количества клеток CD4. Вкратце, сиалогоги, такие как жевательная резинка или лимонная кислота, стимулируют экссудацию сыворотки в слюну всей ротовой полости. После стимуляции экссудации сыворотки активность сывороточного α1PI в слюне измеряют по его способности ингибировать активность эластазы. Панкреатическая эластаза свиньи (PPE) является легкодоступным и недорогим источником эластазы. PPE связывается с α1PI, образуя комплекс в соотношении один к одному, что препятствует расщеплению PPE своих специфических субстратов, одним из которых является колориметрический пептид сукцинил-L-Ala-L-Ala-L-Ala-п-нитроанилид (SA3NA). Инкубирование слюны с насыщающей концентрацией PPE в течение 10 min при комнатной температуре обеспечивает связывание PPE со всем активным α1PI в слюне. Результирующее ингибирование PPE активным α1PI можно измерить путем добавления субстрата PPE SA3NA. (Рисунок 1). Хотя количество клеток CD4 измеряется в пересчете на объем крови (клетки CD4/μl), концентрация α1PI в слюне связана с концентрацией сыворотки в слюне, а не с объемом слюны, так как объем может значительно варьироваться в течение дня и от человека к человеку6. Однако практически весь белок в слюне обусловлен содержанием сыворотки, и содержание белка в слюне поддается измерению7. Таким образом, уровень активного α1PI в слюне рассчитывается как отношение к содержанию белка в слюне и называется индексом α1PI. Результаты, представленные здесь, демонстрируют, что индекс α1PI обеспечивает точный и прецизионный физиологический метод расчета количества клеток CD4.

Протокол

1. Подготовить новую рабочую решения

  1. TBS: 0,05 М Трис-буферном растворе, рН 7,8 (TBS). Подготовить 60 мл TBS / планшет.
  2. СИЗ: свиной поджелудочной железы эластазы, тип 1 (СИЗ) предусмотрена в виде суспензии. Хорошо взболтать и развести СИЗ в TBS примерно 0,01 Ед / мл. Подготовить 6 мл рабочего раствора / планшет).
  3. SA 3 NA: сукцинил-L-Ala-L-Ala-L-Ala-р-нитроанилид (SA 3 NA). Подготовить 0,1 М акции SA 3 NA решение в диметилсульфоксид (ДМСО) и использовать сразу или хранить при температуре -20 ° C. Подготовить 6 мл рабочего раствора / планшет путем разбавления акции SA 3 NA решение 1/100 в TBS.
  4. Coomassie Blue: подготовка исходного раствора 10% Кумасси Brilliant Blue R-250 (Кумасси синий) в TBS и использовать сразу или хранить при -20 ° C. Подготовить 6 мл рабочего раствора путем разбавления исходного раствора, 1/1000 в TBS.

2. Подготовить слюны

  • СЛЮНЫ КОЛЛЕКЦИЯ: В положении стоя, стимулируют выделение сыворотки в слюне, поставив средство, стимулирующее слюноотделение, такие как лимонная кислота или жевательной резинкой во рту. Без сахара, лимонную дольку удобное для ВИЧ-1 пациентов, которые часто беззубой и не жевать резинку. Глотать по мере необходимости в течение первых 3 мин, а также собирать весь слюной рот крышками чашку в течение следующих 3 мин. Это даст примерно 2 мл слюны. Используйте сразу или хранить при температуре -80 ° C.
  • СЛЮНЫ ОБРАЩЕНИЕ: Если замороженная, оттепель образца при 37 ° С и место на льду. Храните свежие или талой образца при температуре 2-4 ° C не более 3 дней. Не вихрь слюны и избежать пипетки муцина который не содержит сыворотку экссудата. Используйте стандартные меры предосторожности при обращении с слюна http://www.cdc.gov/hicpac/pdf/isolation/Isolation2007.pdf .

    • 3. Микропланшетов Настройка

    1. буфер: Измерения проводились в трех экземплярах. Для каждой лунки пластины микротитровальных добавлено 130 мкл TBS.
    2. Образцов: Для каждого теста хорошо, добавляют 20 мкл слюны для конечного объема 150 мкл / лунку. Смешайте с помощью пипетки, не вводя пузыри.
    3. КОНТРОЛЬ: положительный контроль содержит средства индивидуальной защиты, а не слюна. Отрицательный контроль содержит слюны, но не PPE.To положительного контроля и добавляют 20 мкл TBS. Для отрицательного контроля и добавляют 20 мкл слюны.
    4. СИЗ инкубации: Shake средств индивидуальной защиты рабочим раствором хорошо. Добавить 50 мкл рабочего СИЗ раствора в каждую лунку исключая отрицательное скважин управления. К отрицательным скважин контроль, добавить 50 мкл TBS. Инкубировать 10 мин при 23 ° C.
    5. ОСНОВАНИЯ ИНКУБАЦИЯ: Добавить 50 мкл SA 3 NA рабочего раствора в каждую лунку. Инкубировать 45 мин при 23 ° C.
    6. Coomassie Blue. Добавить 50 мкл Кумасси синий рабочий раствор
    7. Считывание: абсорбцию в микропланшетов читателя, 405 нм для выявления SA 3 NA раскол, который представляет активный α 1 ИП и 595 нм для выявления Кумасси синий, которая представляет содержание белка.

    4. Вычислить α 1 ИП Индекс

    1. НОРМАЛИЗАЦИИ в среднем 405 нм и 595 нм: для каждого х экземплярах, вычислить среднее. Вычтите отрицательные средние управления из образцов среднего. Чтобы свести к минимуму пластины к пластине изменения, нормализуют среднем путем деления каждого образца среднем на положительной средней управления следующим образом:

    figure-protocol-1

    1. РАСЧЕТ α 1 ИП INEX: Разделите нормированный 405 нм на нормированную 595 нм:

    figure-protocol-2

    5. Представитель Результаты

    Чтобы определить, α-тест может быть пригоден для использования в качестве отправной точки оказания медицинской помощи скрининг-теста для контроля лимфоцитов CD4 в эндемичных, с ограниченными ресурсами регионах, стимулировало слюны были собраны из 20 женщин и 11 мужчин ВИЧ-1 предметов посещать клинику ежедневного ухода в Камеруне. В соответствии с предварительными замечаниями при разработке α-тест с использованием слюны, собранных в Нью-Йорке, α 1 ИП Индекс в слюне, собранные в Камеруне коррелирует с уровнем CD4 (R 2 = 0,91, р <0,0001. П = 31). Отношение было определено 3 параметра сигмоидального кривой, которая соответствует доза-эффект (рис. 2A). 95% доверительный и прогнозирования интервалы изображены с синей и красной линиями, соответственно (рис. 2В).

    Впредыдущего исследования мы выяснили, что CD4 + Т-клетки проявляют синусоидальной велосипедный с периодичностью 23 ± 3,5 дня в области ВИЧ-1 предметов и у пациентов с унаследованной версии α 1 ИП недостаточности (PIZZ) 3. Изображенный здесь является типичным примером компьютерной синусоиды анализ CD4 на велосипеде в не-ВИЧ-1 здоровым контролем выставки 27 дней периодичность (рис. 3А).

    Созданные с помощью компьютера анализ кривой синус CD4 + Т-клеточных изменений в 6 предметов дали значения от пика до пика амплитуды и оси вращения 3. Как и следовало ожидать, ось колебаний коррелирует с амплитудой (R 2 = 0,96, р = 0,009, п = 6) (рис. 3В). У пациентов будет низким числом CD4 + T-клеток, циклические изменения клеток CD4 Т-клеток были маленькие, и у пациентов с высоким числом CD4 + Т-клеток, циклические изменения были большими.

    Потому чтоЛиния регрессии изображено на рисунке 2 оценкам оси колебаний и ось колебаний коррелирует с амплитудой, амплитуда может быть вычислена для линии регрессии таким образом оценки, насколько выше и ниже линии регрессии CD4 + Т-клетки можно было бы ожидать, чтобы изменяться в зависимости от езда на велосипеде (рис. 3). Наложение амплитуды рассчитаны на рисунке 3C и доверительный интервал рассчитан на рисунке 2B, было установлено, что амплитуда (зеленая линия) находится в пределах 95% доверительного интервала (синяя линия) (рис. 3).

    figure-protocol-3
    Рисунок 1. Процедура информация: Место лимонной кислоты во рту и сбора слюны. Добавить разбавленной слюной лунки планшета в трех экземплярах. Добавить СИЗ в каждую лунку и инкубировать 15 мин при 23 ° C. Добавить подложки СИЗ в каждую лунку и инкубировать в течение 45 мин при 23 ° C. Добавить Кумасси синий и 405 нм для выявления деятельности и средства индивидуальной защиты при 595 нм для обнаружения белка.

    figure-protocol-4
    Рисунок 2. Сравнение α-тест со стандартным методом перечисления CD4. A) α-тест был проведен количественного α 1 ИП индекса в целом стимулировали слюны во рту. Лимфоцитов CD4 было проведено независимой медицинской лаборатории с использованием стандартных проточной цитометрии. Кровь для проточной цитометрии и слюны были собраны в одно посещение клиники. Отношения между α 1 ИП индекс и уровень CD4 был определен 3-параметр сигмоидального кривой (R 2 = 0,91, р <0,0001, п = 31). Б) 95% и прогнозирования интервалов изображен в синем и красном линий, соответственно.

    figure-protocol-5
    Рисунок 3. Точность расчета с CD4ounts использованием α1PI Index.A) CD4 + Т-клеток выставлены синусоидальной езда на велосипеде с 27-дневная периодичность в не-ВИЧ-1 контрольная группа здоровых людей. Оси колебаний изображен (красная пунктирная линия). B) Компьютерная анализ синусоидальной CD4 Т-клеток, езда на велосипеде была использована для расчета пик-пик амплитуды и оси вращения в 4 ВИЧ-1 предметов, 1 без ВИЧ -1 PIzz тему, и не-ВИЧ-1 контрольная группа здоровых людей изображен в части А. Отношения между CD4 + Т клеток и амплитуда колебаний оси было определено 3 параметра сигмоидального кривой (R 2 = 0,96, р = 0,009, п = 6). C) сигмоидального связь между амплитудой и оси колебаний, полученных в части В) была использована для расчета ожидаемой амплитуды (зеленые линии) точек вдоль линии регрессии (черная линия) на рисунке 2. D) ожидаемая амплитуда Интервал (зеленые линии) существенно отличается от 95% доверительный интервал (синие линии), как это определено Манна-Уитни ранг Sum Test (на основе сравнения средняя разница между 95% доверительный интервал и линии регрессии (63 кл / мкл) и средняя разница между амплитудой линии и линии регрессии (37 ячеек / мкл), р = 0,001).

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Обсуждение

    Неразведенный сыворотка содержит среднем 36 мкм α 1 ИП и 3,6 мкМ α 2 макроглобулина (α 2 М) 10-кратную разницу 8. Оба белка конкурируют за связывание с индивидуальной защиты. Эти две характеристики, концентрации и СИЗ близости, были использованы для разработки метода, способного специально измерения α 1 ИП в сыворотке в присутствии конкурирующих α 2 M 8. Этот метод позволяет обнаруживать лишь 50 нм μ 1 ИП в 0,3% сыворотки. На разведе...

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Раскрытие информации

    Нет конфликта интересов объявлены.

    Благодарности

    Исследование было поддержано Harry Winston исследовательский фонд.

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Материалы

    Список материалов, использованных в этой статье
    ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
    Название реагента Компания Номер по каталогу
    Средство, стимулирующее слюноотделение, 0,05 М лимонной кислоты Еда на конфеты без сахара, 4900 Задняя N.20th Street, Philadelphia, PA 19144 Без сахара капель лимонного
    Свиной поджелудочной железы эластазы, тип 1 (EC 3.4.21.36) Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури 63103 E1250
    Сукцинил-L-Ala-L-Ala-L-Ala-р-нитроанилид Sigma-Aldrich S4760
    Кумасси Brilliant Blue R-250 Sigma-Aldrich B7920
    Культура тканей обработанных, 96 планшетов Becton Dickinson, Франклин озер, NJ 07417-1886 35-3072
    Считыватель микропланшетов с фильтрами 405 нм и 595 нм MTX лаборатории Systems, 8456 Tyco Road, Буйlding D, Вена, Вирджиния 22182 Dynex P97277

    Ссылки

    1. Friedlander, Y., Kark, J. D., Eisenberg, S., Stein, Y. Calculation of LDL-cholesterol from total cholesterol, triglyceride and HDL-cholesterol: a comparison of methods in the Jerusalem Lipid Research Clinic Prevalence Study. Isr. J. Med. Sci. 18, 1242-1252 (1982).
    2. Lapidot, T., Petit, I. Current understanding of stem cell mobilization: The roles of chemokines, proteolytic enzymes, adhesion molecules, cytokines, and stromal cells. Exp. Hematol. 30, 973-981 (2002).
    3. Bristow, C. L. α1Antitrypsin therapy increases CD4+ lymphocytes to normal values in HIV-1 patients. Soluble factors mediating innate immune responses to HIV infection. Alfano, M. , Bentham Science Publishers. (2010).
    4. Bristow, C. L., Patel, H., Arnold, R. R. Self antigen prognostic for human immunodeficiency virus disease progression. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 8, 937-942 (2001).
    5. Bristow, C. L., Babayeva, M. A., LaBrunda, M., Mullen, M. P., Winston, R. α1Proteinase Inhibitor regulates CD4+ lymphocyte levels and is rate limiting in HIV-1 disease. PLoS One. , Forthcoming (2011).
    6. de Almeida, P. D. V., Gregio, A. M. T., Machado, M. A. N., de Lima, A. A. S., Azevedo, L. R. Saliva Composition and Functions: A Comprehensive Review. J. Contemp. Dent. Pract. 9, 72-80 (2008).
    7. Edgar, W. M. Saliva: its secretion, composition and funcitons. Br. Dent. J. , 172-305 (1992).
    8. Bristow, C. L., Meo, F. di, Arnold, R. R. Specific activity of α1proteinase inhibitor and 2macroglobulin in human serum: Application to insulin-dependent diabetes mellitus. Clin. Immunol. Immunopathol. 89, 247-259 (1998).
    9. Pederson, E. D. Salivary levels of α2-macroglobulin, α1-antitrypsin, C-reactive protein, cathepsin G and elastase in humans with or without destructive periodontal disease. Arch. Oral Biol. 40, 1151-1155 (1995).
    10. Shak, S., Capon, D. J., Hellmiss, R., Marsters, S. A., Baker, C. L. Recombinant human DNase I reduces the viscosity of cystic fibrosis sputum. PNAS. 87, 9188-9192 (1990).
    11. LeVeque, F. G. A multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled, dose- titration study of oral pilocarpine for treatment of radiation-induced xerostomia in head and neck cancer patients. J. Clin. Oncol. 11, 1124-1131 (1993).
    12. Stevens, W. Evaluating new CD4 enumeration technologies for resource-constrained countries. Nat. Rev. Microbiol. 6, S29-S38 (2008).
    13. WHO. 2010 ART guidelines for adults and adolescents - evidence map. , Available from: http://www.who.int/hiv/topics/treatment/evidence/en/index.html (2010).

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Перепечатки и разрешения

    Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

    Запросить разрешение

    Теги

    1SA3NA

    Похожие статьи