Методическая статья

Подготовка T фактор роста клеток от Крыса Спленоциты

DOI:

10.3791/402

⸱

31 октября 2007 г.

 , 
1Department of Physiology and Biophysics, University of California, Irvine (UCI)

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы описываем подготовки Т-клеток фактор роста для в пробирке расширения антиген-специфических Т-лимфоцитов крыс линии.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Поддержание антиген-специфических Т-клеток линий или клонов в культуре требует раундов антиген-индуцированной активации разделенных фаз клеточного 1,2 экспансии. Добавление интерлейкина-2 в культуре средств массовой информации во время фазы расширения необходимо предотвратить гибель клеток и достаточно для поддержания краткосрочной линии Т-клеток, но было показано, что увеличение Th1 поляризации 3. Замена интерлейкин 2, Т-клеточный фактор роста (TCGF), который содержит смесь цитокинов является более эффективным, чем интерлейкина-2 в поддержании долгосрочной линии Т-клеток в пробирке 3. Более того, TCGF могут быть легко получены в больших количествах в лаборатории и намного дешевле, чем рекомбинантный интерлейкин 2.

Здесь мы покажем, как готовить TCGF от крыс спленоцитов супернатантах культуры. Для этой процедуры, жмем селезенки от наивных крыс Льюиса эвтаназии для тимуса и сбора крови. Мы готовим одноклеточных суспензий из селезенки, лизировать эритроциты от осмотического шока, и семян спленоцитов в культуральной среде. Клетки стимулировали конканавалин, митоген, что не-выборочно активирует все лимфоцитов крыс T, вызывая продукцию цитокинов. Культуры supernantant собирается через 48 часов andexcess конканавалин связан с альфа-метил mannoside, чтобы предотвратить его активации Т клеточных линий на которых TCGF будет добавлен. TCGF затем стерильно фильтруют, аликвоты и хранили при температуре -20 ° C.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Возьмите Льюис крысы селезенки (крысы между 160-200г лучше). Dilacerate на льду в чашке Петри содержащие PBS + антибиотики (PBS-ПС) с использованием ячейки фильтра. Положить в 50 мл трубки. Залейте PBS-PS.
  2. Спиновые течение 10 мин при 4 ° С для осаждения клеток.
  3. Вымойте клетки в два раза.
  4. Ресуспендируют пеллет в NH 4 Cl 0,15 М (5 мл на селезенки). Осторожно перемешать и постоянно с пипеткой в течение 3 минут на льду лизировать эритроциты. Заполните трубку со средой.
  5. Спиновые течение 10 мин при 4 ° С для осаждения клеток.
  6. Вымойте клетки в два раза.
  7. Граф клеток. Крыса селезенки дает 200-250 миллионов клеток.
  8. Семенной клетки в 2 млн. на мл в полной среде: 50 мл на 75 см 2 колбы.
  9. Давайте расти в течение 48 часов в инкубаторе.
  10. Спиновые 15 мин при 4 ° С для осаждения клеток.
  11. Сбор супернатант; отказаться от клеток.
  12. Добавить в дозе 15 мг / мл метилового mannoside в супернатант. Тщательно перемешать.
  13. Фильтр (0,2 мм)
  14. Алиготе и хранить при температуре -20 ° C. Может храниться при 4 ° С в течение 10 дней, если это необходимо.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы готовим TCGF из спленоцитов крыс Льюиса, так как мы регулярно эвтаназии наивные крыс от этого штамма для сбора сыворотки и thymi стимулировать Льюис крыс линии Т-клеток в пробирке. Это TCGF может быть использована для поощрения роста и выживания Т клеточных линий из других штаммов крысы. TCGF также могут быть получены от других штаммов крыс.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Материалы

Для подготовки полной культуральной среде добавьте следующие строки в 500 мл бутылка RPMI 1640 и стерильный фильтр: 10% FCS, 1 бутылка ПСЖ, 5 мл RPMI витаминов; 5 мл пирувата натрия, 5 мл без незаменимых аминокислот, 50 мкМ бета-меркаптоэтанол, 2 мкг / мл конканавалин А.

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Beeton, C., Barbaria, J., Devaux, J., Benoliel, A. -M., Gola, M., Sabatier, J. -M., Bernard, D., Crest, M., Beraud, E. Selective blocking of voltage-gated K+ channels treats experimental autoimmune encephalomyelitis and inhibits T-cell activation. J. Immunol. 166, 936-944 (2001).
  2. Beeton, C., Wulff, H., Barbaria, J., Clot-Faybesse, O., Pennington, M., Bernard, D., Cahalan, M. D., Chandy, K. G., Beraud, E. Selective blockade of T lymphocyte K+ channels ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis, a model for multiple sclerosis. Proc. Natl. Acad. 98, 13942-13947 (2001).
  3. Mor, F., Cohen, I. R. Propagation of Lewis rat encephalitogenic T cell lines: T-cell-growth-factor is superior to recombinant IL-2. J. Neuroimmunol. 123, 76-82 (2002).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Concanavalin A StimulationCytokine ProductionRed Blood Cell LysisSingle Cell SuspensionSterile FiltrationAlpha Methyl MannosideCell Culture SupernatantT Cell Line Maintenance

Похожие статьи