Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Affinity очистки вируса гриппа рибонуклеопротеидных комплексов с хроматина инфицированных клеток

12.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/4028

⸱

3 июня 2012 г.

 , 
1Department of Virology, Universitätsklinikum Freiburg

В этой статье

Краткое содержание

Вирусы гриппа повторить их РНК-геном в связи с хост-клеточного хроматина. Здесь мы представляем метод, чтобы очистить нетронутыми вирусных комплексов рибонуклеопротеидных из хроматина инфицированных клеток. Очищенный вирусный комплексы могут быть проанализированы и Вестерн-блот и удлинения праймера белка и РНК, соответственно.

Аннотация

Как и у всех РНК-вирусов с отрицательной полярностью цепи, геном вирусов гриппа упакован в виде вирусных рибонуклеопротеиновых комплексов (vRNP), в которых одноцепочечный геном инкапсидирован нуклеопротеином (NP) и ассоциирован с тримерным полимеразным комплексом, состоящим из субъединиц PA, PB1 и PB2. Однако, в отличие от большинства РНК-вирусов, вирусы гриппа осуществляют синтез вирусной РНК в ядрах инфицированных клеток. Интересно, что при синтезе вирусной мРНК в качестве праймеров используются клеточные пре-мРНК, и было высказано предположение, что этот процесс происходит на хроматине1. Также были охарактеризованы взаимодействия между вирусной полимеразой и РНК-полимеразой II хозяина, а также между NP и нуклеосомами хозяина1,2.

Недавно было описано создание рекомбинантных вирусов гриппа, кодирующих One-Strep-Tag, генетически слитый с C-концом субъединицы PB2 вирусной полимеразы (rWSN-PB2-Strep3). Эти рекомбинантные вирусы позволяют очищать комплексы, содержащие PB2, включая вРНП, из инфицированных клеток. Для получения очищенных вРНП проводят инфицирование клеточных культур, после чего вРНП выделяют методом аффинной очистки из полученных лизатов этих клеток. Однако применяемые до настоящего времени процедуры лизиса были основаны на одностадийном детергентном лизисе, который, несмотря на присутствие общей нуклеазы, зачастую неэффективно экстрагирует связанный с хроматином материал.

Наши предварительные исследования показали, что значительная часть ядерных вРНП не извлекается при традиционном лизисе клеток и, следовательно, не может быть очищена методом аффинной хроматографии. Чтобы повысить эффективность экстракции и разделить связанные с хроматином и несвязанные с хроматином ядерные вРНП, мы адаптировали протокол пошагового субклеточного фракционирования для клеток, инфицированных вирусом гриппа. Вкратце, данная процедура сначала отделяет ядра от клеток, а затем экстрагирует растворимые ядерные белки (обозначенные здесь как «нуклеоплазматическая» фракция). Оставшийся нерастворимый ядерный материал подвергается воздействию Benzonase, неспецифической ДНК/РНК-нуклеазы, после чего следуют два этапа солевой экстракции: сначала с использованием 150 mM NaCl (обозначено как «ch150»), затем 500 mM NaCl («ch500») (Рис. 1). Эти этапы солевой экстракции были выбраны на основании нашего наблюдения, что 500 mM NaCl достаточно для солюбилизации более 85% ядерных вРНП, при этом сохраняется способность меченых вРНП связываться с аффинной матрицей.

После субклеточного фракционирования инфицированных клеток можно провести аффинную очистку vRNP с PB2-меткой из каждой отдельной фракции и проанализировать их белковые и РНК-компоненты с помощью вестерн-блоттинга и праймер-экстензии соответственно. Недавно мы использовали этот метод и обнаружили, что комплексы экспорта vRNP формируются на поздних этапах после инфицирования во фракции хроматина, экстрагированной 500 mM NaCl (ch500)3.

Протокол

Схема схема протокола показан на рис. 1 и таблицы реагентов приведены ниже.

1. Инфекция (16 - 24 ч)

  1. Семенной из клеток HeLa в 5 150 мм пластиковый культуре клеток блюд в среде Дульбекко изменения Орла (DMEM) высокого среднего глюкозы, например, что они достигнут примерно 80% слияния на следующий день (примерно 5 х 10 8 клеток). Очень важно, что клетки не достигают 100% слияния.
  2. На следующий день, развести Strep с метками акции вируса гриппа в фосфатно-солевом буфере (PBS), содержащего 0,3% бычьего сывороточного альбумина (БСА) до множества инфекций 3.
  3. Удалить рост средней из клеток, мыть один раз PBS, и добавить 10 мл PBS, содержащего вируса в клетки. Выдержите в течение 1 часа при комнатной температуре.
  4. Замените инфекции среды DMEM-высокий уровень глюкозы, и продолжают инкубацию при 37 ° C.
"> Длина инкубации зависит от фазы инфекции должны быть изучены (см. Обсуждение).

2. Субклеточных фракционирования (3 ч)

  1. Промойте клетки сразу с холодным ФСБ, а затем приостановить клетки в холодном PBS скребком резиновых и трансфер в 50 мл коническую трубку.
  2. Гранул клеток в настольной центрифуге в течение 5 мин при 1000 оборотов в минуту, а затем вдохнуть PBS.
  3. Ресуспендируют осадок клеток в 10 мл холодного буфера сахарозы (10 мМ HEPES рН 7,9, 10 мМ KCl, 2 мМ Mg ацетат (MgOAc), 3 мМ CaCl 2, 340 мМ сахарозы, 1 мМ ДТТ (DTT), 1% смеси ингибиторов протеазы) . После подвески, проходят через клетки в 200 мкл кончике пипетки прикреплен к 10 мл сыворотки пластиковых пипетки нарушить клетки сгустки.
  4. Выдержите 10 минут на льду. Аккуратно перевернуть периодически ресуспендирования клеток.
  5. Добавить Nonidet Р-40 (NP-40) до конечной концентрации 0,5% и вихря на высокой скорости в течение 15 сек. Сразу центрифуги в течение 10 мин при 3500 мкг на 4 ° C в настольный центрифугированияGE.
  6. Удалить супернатант и хранить при температуре 4 ° C. Это цитоплазматической фракции. Осадок должен быть меньше и светлее, чем исходный осадок клеток. Все фракции могут храниться в течение не менее 4 ч при температуре 4 ° C.
  7. Промойте осадок в 5 мл холодного буфера сахарозы, повторно центрифуги, как в пункте 2.5 и отказаться от супернатант.
  8. Ресуспендируют гранул (содержащих ядра) в 1,5 мл холодной нуклеоплазме буфера для экстракции (50 мМ HEPES рН 7,9, 150 мМ KOAc, 1,5 мМ MgCl 2, 0,1% NP-40, 1 мМ DTT, 1% смеси ингибиторов протеазы).
  9. Трансфер в охлажденном, все стекла 4 мл Dounce гомогенизатор с плотно закрывающейся пестик и гомогенизации ядер с 20 ударов.
    Избегать образования пены во время гомогенизации. Сопротивление должно увеличиться после того, как около 10 ударов. Эффективность гомогенизации может быть подтверждено под микроскопом фазового контраста.
  10. Передача усредненного ядер 1.5 трубки микроцентрифужных мл и инкубировать 20 минут на вращающееся колесо при 4 °C.
  11. Центрифуга при 16000 х г в микроцентрифуге при 4 ° С в течение 10 мин.
  12. Удалить супернатант и хранить при температуре 4 ° C. Это нуклеоплазме фракции.
  13. Ресуспендируют осадок в 1,5 мл пищеварения буфера (50 мМ HEPES рН 7,9, 10 мМ NaCl, 1,5 мМ MgCl 2, 1 мМ DTT, 1% смеси ингибиторов протеазы 100 ЕД / мл Benzonase (для анализа РНК, замена с 20 Ед / мл РНКазы без ДНКазы I)), предварительно нагревают до 37 ° C, и инкубировать 10 мин при 37 ° C.
  14. Добавить 42 мкл 5 М NaCl (для конечной концентрации 150 мМ NaCl) и инкубировать 20 мин дальнейшем при 4 ° C.
  15. Центрифуга при 16000 х г в микроцентрифуге при 4 ° С в течение 10 мин.
  16. Удалить супернатант и хранить при температуре 4 ° C. Это CH150 фракции.
  17. Ресуспендируют осадок в 1,5 мл холодной высокого соль буфера (50 мМ HEPES рН 7,9, 500 мМ NaCl, 1,5 мМ MgCl 2, 0,1% NP-40, 1 мМ DTT, 1% смеси ингибиторов протеазы) и инкубировать 20 минут на льду.
  18. Центрифуга при 16000 х г </ EM> в микроцентрифуге при 4 ° С в течение 10 мин.
  19. Удалить супернатант и хранить при температуре 4 ° C. Это ch500 фракции.

3. Strep-теги очистки (2 ч)

  1. Добавить 300 мкл 5 М NaCl в цитоплазматической фракции (для конечной концентрации 150 мМ NaCl).
  2. Алиготе 100 мкл упакованы Strep-Tactin бисером сефарозе в долю в 15 мл коническую трубку.
  3. Добавить 10 томов буфер Strep стирки (20 мМ HEPES рН 7,9, 150 мМ NaCl (500 мМ NaCl для ch500 образцов), 1 мМ ЭДТА) для бисера, переверните пробирку перемешать, и центрифуги 5 минут при 1000 х г в настольном центрифуги.
  4. Удалить супернатант, повторите шаг 3,3 раза, а затем ресуспендируют шарик шарик в равном объеме промывочного буфера Strep.
  5. Добавить 200 мкл промытый Strep-Tactin суспензии шарик для каждой фракции (в 1,5 мл микроцентрифужных труб для nuceloplasmic, CH150 и ch500 фракций и 15 мл коническую трубку для цитоплазматической фракции).
  6. ВращатьТрубы 1 час при температуре 4 ° C на вращающемся колесе.
  7. Пробирок 1 мин при 1000 х г при 4 ° C. Удалить супернатант.
  8. Добавить 1 мл холодной промывочного буфера Strep в каждую пробирку. Передача бусы из 15 мл трубку (цитоплазматической фракции) до 1,5 мл трубки. Вымойте все трубы 1 мин при 4 ° С, после центрифугирования, как в пункте 3.7. Повторите этот шаг мыть два раза.
  9. После того, как последний этап стирки, удаление всех следов моющего буфера с помощью плоской кончиком пипетки. Добавить 100 мкл буфера для элюции (Strep промывочного буфера, содержащего 2,5 мМ desthiobiotin) и аккуратно перемешать.
  10. Выдержите 15 минут на льду. Аккуратно перемешайте бисер иногда, нажав в нижней части трубы.
  11. Пробирки центрифужные 1 мин при 1000 х г при 4 ° С в микроцентрифужных. Соберите супернатант, содержащий элюированных Strep с метками vRNPs.

4. Представитель Результаты

Эффективность фракционирования лучше всего судить по Вестерн-блот анализе фракционированного лизатов использованием Антибodies специфичные для субклеточных маркеров (рис. 2). В частности, успешный субъядерных фракционирования должен показать мало или нет сотовой РНК-полимеразы II (Пол II) в нуклеоплазме или растворимый ядерной фракции 4, и большинство должны быть извлечены с 150 мМ NaCl, 5. Деградация Pol II также воспроизводимо наблюдается при гриппе инфицированных вирусом клеток по сравнению с неинфицированных клетках, в соответствии с литературными 6.

Очистка vRNPs лучше всего судить по серебра или окрашивание Кумасси, как показано на цитоплазматической элюата на рис. 3. По нашему опыту, наиболее Strep-PB2 очищается в качестве части полностью сформированный vRNP, т.е. мало растворим полимеразы в плен. Это нашло свое отражение в высоких Н.П.: PA/PB1/PB2 соотношение наблюдалось серебра или Кумасси окрашивания. Низкое соотношение предлагает буфер загрязнения РНКазы, а несколько вездесущий РНКазы (например, РНКазы), как известно, расщепляет вирусную РНК таким образом, чтобы диссоциацииели-полимеразы из НП мультимеры 7. Интересно, что лечение с Benzonase в одиночку, а достаточно, чтобы переварить вирусной РНК, по-видимому, не влияет на стехиометрических отношениях vRNP белков. Хотя мы не можем объяснить этот феномен, мы наблюдали нарушение vRNPs после переваривания с другими РНКазы (данные не представлены), предполагая, что Benzonase может оставить определенные структурно важных РНК регионах нетронутыми. После очистки vRNPs из цитоплазмы и нуклеоплазму (выполняется без пищеварение нуклеазы), 8 слабый, но дискретные группы с высоким молекулярным весом можно наблюдать, серебрения, которые соответствуют предсказанным молекулярным весом 8 сегментов генома гриппа (см. ссылку 3. ).

Относительные количества vRNPs очищенный от каждой фракции в 9 ч после инфекции, показаны на рис. 4. Распределение vRNPs меняется в течение инфекции, с сильным накоплением в CH150 долю на ранних моментов времени, иповышенное накопление в нуклеоплазме и цитоплазмы в конце моменты времени.

figure-protocol-1
Рисунок 1. Блок-схема субклеточном фракционирования. Адаптировано из работы. 3.

figure-protocol-2
Рисунок 2. Вестерн-блот анализа субклеточных фракций из инфицированных вирусом гриппа клетки. 10 9 HeLa клетки были инфицированы штаммом вируса гриппа WSN за 9 ч до субклеточном фракционирования. Равные количества общего белка были загружены в каждом переулке и проанализированы с помощью антител показано на рисунке. РНК-полимеразы II (Пол II) было обнаружено использование клонов 8WG16, который признает все формы С-концевой домен (hypophosphorylated группы наиболее заметно). Адаптировано из работы. 3.

figure-protocol-3
Рисунок 3.Серебряное пятно анализ очищенной vRNPs. HeLa клетки были инфицированы rWSN (в качестве отрицательного контроля) или rWSN-PB2-Strep за 9 ч, после чего Strep очистки от цитоплазматической фракции. Asterisk обозначает группы, которые не видны после переваривания РНКазы. Адаптировано из работы. 3.

figure-protocol-4
Рисунок 4. Серебряный пятна анализ vRNPs очищается от различных клеточных фракциях. 10 9 HeLa клетки были инфицированы rWSN-PB2-стрептококками или rWSN за 9 ч следует субклеточном фракционирования и Strep очистки. Равное количество элюата от каждой фракции были загружены. Адаптировано из работы. 3.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Хотя многие исследования недавно выявили отдельные белки или сотовой сети, участвующие в вирус гриппа инфекцию 8, функциональное значение большинства этих взаимодействий остается неясным. Учитывая абсолютную зависимость хроматина на основе функций для вируса гриппа синтез РНК и сложных биофизических и биохимических природу ядра 9, новые технологии должны будут выяснить эти функции. Субъядерных фракционирования мы представляем здесь, в сочетании с близостью очистки vRNPs, позволяет характеристику ва...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить Нада Naffakh и Мари-Анн-Rameix Вельти (Institut Pasteur) в rWSN-PB2-Strep вируса.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Название реагента Компания Номер по каталогу Комментарии
DMEM-высокий уровень глюкозы Гибко 11965-092
BSA Сигма A9418
Ингибитор протеазы Mix G Serva 39101
Benzonase нуклеазы Novagen 71206 25 U / мкл
ДНКазы I, без РНКазы ThermoScientific EN0523 50 ед / мкл
Dounce гомогенизатор Уитон 432-1271 Используйте тип "B" пестик
Strep-Tactin сефарозы IBA GmbH 2-1201-025 50% Формат подвески колонка также может быть использована
Desthiobiotin IBAGmbH 2-1000-002

Ссылки

  1. Engelhardt, O. G., Smith, M., Fodor, E. Association of the influenza A virus RNA-dependent RNA polymerase with cellular RNA polymerase II. J. Virol. 79, 5812-5812 (2005).
  2. Garcia-Robles, I., Akarsu, H., Müller, C. W., Ruigrok, R., Baudin, F. Interaction of influenza virus proteins with nucleosomes. Virology. 332, 329(2005).
  3. Chase, G. P., Rameix-Welti, M. A., Zvirbilene, A., Zvirblis, G., Götz, V., Wolff, T., Naffakh, N., Schwemmle, M. Influenza virus ribonucleoprotein complexes gain preferential access to cellular export machinery through chromatin targeting. PLoS Pathogens. 7, e1002187(2011).
  4. Kimura, H., Tao, Y., Roeder, R. G., Cook, P. R. Quantitation of RNA polymerase II and its transcription factors in an HeLa cell: little soluble holoenzyme but significant amounts of polymerases attached to the nuclear substructure. Mol. Cell. Biol. 19, 5383-5383 (1999).
  5. Henikoff, S., Henikoff, J. G., Sakai, A., Loeb, G. B., Ahmad, K. Genome-wide profiling of salt fractions maps physical properties of chromatin. Genome Res. 19, 460(2009).
  6. Rodriguez, A., Perez-Gonzalez, A., Nieto, A. Influenza virus infection causes specific degradation of the largest subunit of cellular RNA polymerase II. J. Virol. 81, 5315-5315 (2007).
  7. Ye, Z., Liu, T., Offringa, D. P., McInnis, J., Levandowski, R. A. Association of influenza virus matrix protein with ribonucleoproteins. J. Virol. 73, 7467-7467 (1999).
  8. Watanabe, T., Watanabe, S., Kawaoka, T., Y, Cellular networks involved in the influenza virus life cycle. Cell Host Microbe. 7, 427(2010).
  9. Engelhardt, O. G., Fodor, E. Functional association between viral and cellular transcription during influenza virus infection. Rev. Med. Virol. 16, 329-345 (2006).
  10. Schwartz, L. B., Sklar, V. E., Jaehning, J. A., Weinmann, R., Roeder, R. G. Isolation and partial characterization of the multiple forms of deoxyribonucleic acid-dependent ribonucleic acid polymerase in the mouse myeloma, MOPC 315. J. Biol. Chem. 249, 5889(1974).
  11. Lambert, J. P., Baetz, K., Figeys, D. Of proteins and DNA--proteomic role in the field of chromatin research. Mol. Biosyst. 6, 30(2010).
  12. Wu, C. Y., Jeng, K. S., Lai, M. M. The SUMOylation of matrix protein M1 modulates the assembly and morphogenesis of influenza A virus. J. Virol. 85, 6618(2011).
  13. Liao, T. L., Wu, C. Y., Su, W. C., Jeng, K. S., Lai, M. M. Ubiquitination and deubiquitination of NP protein regulates influenza A virus RNA replication. EMBO J. 29, 3879(2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Синтез вирусной РНКфракционирование хроматинасубклеточное фракционированиерасщепление бензоназойэкстракция сольювестерн-блот-анализанализ по методу расширения праймеровочистка с использованием Strep-Tag
Affinity очистки вируса гриппа рибонуклеопротеидных комплексов с хроматина инфицированных клеток
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.