Методическая статья

Человека маточных труб модель для исследования

15.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/4036

⸱

11 августа 2012 г.

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Medical Microbiology and Hygiene, University of Lübeck, 2Institute of Anatomie, University of Lübeck, 3Department of Obstetrics and Gynecology, University Hospital of Schleswig-Holstein, University of Lübeck, 4Medical Clinic III, University Hospital of Schleswig-Holstein, University of Lübeck

В этой статье

Краткое содержание

Мы описываем Бывший естественных условиях заражение Модель для визуализации прямого взаимодействия с бактериальными патогенами с человеческими клетками маточных труб. Вся модель ткани органа была создана для расследования С. трахоматис Индуцированной патологии женских маточных труб при "жизни, как" условия.

Аннотация

Инфекций половых путей с хламидиоза (хламидийной) являются наиболее частыми передается половым путем заболеваний у женщин по всему миру. Неэффективное разрешение или сохранение патогенов может привести к возрастанию инфекции верхних половых путей и, как предполагается, вызывают хронические воспалительные повреждения инфицированных 1,2 ткани. Как следствие, серьезные клинические осложнения, как воспалительные заболевания тазовых органов (PID), окклюзии маточных труб и бесплодие может возникнуть 3,4.

Большинство исследований с C. трахоматис была проведена в эпителиальных клеточных линий (например, клеток НЕр-2 и HeLa-229) или у мышей. Однако, как и клеточных культур на основе моделей, они не отражают физиологии родной ткани, ни патофизиологии C. трахоматис половых инфекций в естественных условиях 5. Дальнейшие ограничения задаются на то, что центральные сигнальных каскадов (например, ИФН-γ mediatред JAK / STAT сигнального пути), которые контролируют внутриклеточную хламидийной рост принципиально отличаются от мышей и человека 6,7. Мы и другие поэтому создали целый орган маточных труб модель для исследования прямых взаимодействий между C. трахоматис и человеческих клеток фаллопиевых труб бывших естественных 8,9.

Для этого человека маточных труб у женщин, подвергающихся гистерэктомии были собраны и инфицированных C. трахоматис серовар D. В течение 24 ч после инфекции, образец которой анализировались с помощью сканирующего электронного микроскопа (SEM) и просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) с целью выявления хламидиоза опосредовано эпителиальных повреждений, а также C. трахоматис включения образования в маточной ткани.

Протокол

1. Подготовка хламидиоза со серовар D

  1. Инфекция сливной 175 см 2 ячейка культуры колбу HeLa-229 ячеек с 4 мл C. трахоматис D в СПГ буфера.
  2. Выдержите в течение одного часа при 37 ° С при постоянном встряхивании.
  3. Добавить 20 мл DMEM с 10% FCS и 240 мкл циклогексимида.
  4. Инкубируйте в увлажненном инкубаторе в течение 48 ч при температуре 37 ° С и 5% CO 2.
  5. Добавьте 5 мл стерильной стеклянные бусины, сильные сотрясения, чтобы отделить и уничтожить C. трахоматис укрывательство HeLa-229 клеток.
  6. Соберите супернатант и добавить еще 5 мл стерильной стеклянные бусы.
  7. Рок-три раза в течение 1 мин, чтобы уничтожить все HeLa-229 клеток и освобождение С. инфекцией.
  8. Центрифуга в течение 5 мин при 1000 RPMI и 4 ° C, чтобы избавиться от продуктов распада клеток.
  9. Соберите супернатант инфекции от 8 до 10 175 см 2 клеточной культуре колб сливной гrown с HeLa 229 клеток.
  10. Инкубируйте каждую колбу с 4 мл буфера СПГ и 4 мл надосадочной от перенесенной инфекции в течение одного часа при температуре 37 ° C с постоянной тряски.
  11. Через час добавить 15 мл DMEM с 10% FCS и 230 мкл циклогексимид следуют на 48 ч инкубации при температуре 37 ° С и 5% CO 2.
  12. Добавьте 5 мл стерильной стеклянные бусины, встряхнуть, чтобы отделить и уничтожить C. трахоматис укрывательство HeLa-229 клеток.
  13. Соберите супернатант и добавить еще 5 мл стерильной стеклянные бусы.
  14. Рок-три раза в течение 1 мин, чтобы уничтожить все HeLa-229 клеток и освобождение С. инфекцией.
  15. Центрифуга в течение 5 мин при 1000 RPMI при температуре 4 ° C, чтобы избавиться от продуктов распада клеток.
  16. Соберите супернатант.
  17. Заполнить 40 мл супернатанта в 50 мл пробирок Falcon, центрифуга для 99 мин с 11 000 RPMI.
  18. После центрифугирования супернатант отбросить и промыть осадок 1 мл СПГ буфера.
  19. Однородныйгранул в 1 мл СПГ и аликвоту 20 мкл в 1, 5 мл Eppendorf трубку, хранить при -70 ° С до использования. Биологическая активность подготовленной акции было подтверждено в установленном HeLa-229 модель распространения инфекции в клетке.

2. Подготовка человека маточных труб

  1. Магазин человека труб фаллопиевых (HFT) из женщин, перенесших гистерэктомию сразу после операции в RPMI, содержащем 5% FCS без антибиотиков в 4 ° C до приготовления. Протокол исследования был одобрен этическим комитетом университета Любека (09-153). Женщины, включенных в исследование (34 лет до 53) не имели в анамнезе C. трахоматис инфекции. Ткани маточных труб была собрана в peripartum стерилизации на материнскую просьбу во время кесарева сечения или во время гистерэктомии в связи с симптоматической миомы матки в лютеиновой фазе. Все HFT были отрицательными для C. трахоматис методом ПЦР.
  2. Проанализируйте HFT в чашке Петри содержащей RPMI с5% FCS без антибиотиков. На протяжении всей обработки ткани должны быть погружены в средствах массовой информации, чтобы предотвратить высыхание.
  3. Отрежьте и удалите соединительной ткани и ткани уничтожена во время операции.
  4. После вскрытия открыть HFT тщательно с небольшим скальпелем.
  5. Для дальнейших экспериментов подготовить кусочки ткани размером 0,5 см х 0,5 см до 1 см х 1 см.
  6. Для заражения образца HFT магазин в 1 мл RPMI, содержащем 5% FCS без антибиотиков. HFT образцов были заражены 5.5x10 5 IFU (включение образующих единиц) С. инфекцией.
  7. Инкубируйте HFT образца в 37 ° C, 5% СО 2 и 21% O 2, а также в 37 ° C, 5% СО 2 и 2% O 2 в течение 24 часов.
  8. После инкубационного периода сбора образцов и фиксатора магазина в Монти, по крайней мере трех дней при температуре 4 ° С до SEM / TEM подготовки.

3. Подготовка образцов для HFT TEM

  1. ДляТЕМ удаления образца из фиксатора Монти и сократить 2 х 2 мм до 4 х 5 мм штук. Остальные ткани могут быть использованы для SEM.
  2. Вымойте части натрия какодилатном буфер, рН 7,35 за 1 час.
  3. Инкубируйте в 1% (вес / объем) осмия в дистиллированной воды. за одну ночь.
  4. Удалите излишки четырехокиси осмия промывкой 6х5 мин натрия какодилатном буфер, рН 7.35.
  5. Удаление воды путем инкубации в возрастающих концентрациях этанола в воде (об / об) (30% в течение 2 ч, 40% в течение 2 ч, 50% в течение 2 ч, 60% в течение 2 ч, 70% за ночь, 80% в течение 2 ч, 90% в течение 1 ч, 95% в течение 1 ч, 100% в течение 1 часа.
  6. Промыть этанола в течение 2 х 15 мин в окись пропилена, а затем перевестись в смеси 50% (объем / объем) свежеприготовленного аралдит (включая все компоненты) в пропилен и инкубировать в течение ночи.
  7. Трансфер в свежеприготовленный аралдит (включая все компоненты) по крайней мере 1 час.
  8. Переход к плоской формы вложения и заполнить аралдит.
  9. Давайте аралдит отвержденияпо крайней мере 48 часов при 60 ° C
  10. После обрезки встроенных образце, вырезанном полу тонких срезов (700 нм) на ультрамикротомом использованием стекла ножи или нож историка алмазов и пятно пятно Ричардсона.
  11. Вырезать ультра-тонких срезов (около 70 нм) с помощью ножа алмазов и передачи медные сетки (например, 150 квадратными ячейками).
  12. Пятно ультра-тонких срезов с 0,5% (вес / объем) уранилацетата в дистиллированной воды. затем по 3% (вес / объем) цитратом свинца в дистиллированной воды. в автоматическом ситечко разделе. Кроме того, разделы могут быть окрашены вручную, оставив сети 15 мин центрифугировали насыщенный раствор ацетата уранила в дистиллированной воды. затем 0,3% цитратом свинца (вес / объем) в дистиллированной воды.

4. Подготовка HFT образца для SEM

  1. Для SEM удаления образца из фиксатора Монти, сориентироваться в эпителии вверх на 1,5 х 1 см листа пробки и исправить положение с помощью насекомых иглы.
  2. Передача образца на пробки подходящие корзины металлов имыть в течение 30 мин натрия какодилатном буфер, рН 7.35.
  3. Удаление воды путем инкубации образца в увеличении концентрации ацетона / воды смеси (объем / объем) 30% в течение 6 часов, 40% в течение 6 часов, 60% в течение 8 ч, 70% за ночь, 80% в течение 2 ч, 90% 2 ч и 100% за одну ночь (быть крайне осторожными, чтобы сохранить образец непрерывно погруженной).
  4. Трансфер в свежем 100% ацетона и сухого образца на критическую точку сушки (температура 40 ° C, давление 80 бар).
  5. Удалите иглы, пробки и клей образца с эпителием вверх на гору образца SEM оснащена проводящей вкладке углерода использованием проводящих цемента углерода. Использование жидкого проводящего серебра для повышения проводимости между креплением и проводящие закладку углерода.
  6. Подготовить проводящее покрытие платины, золота или палладия образца помощью нанесения покрытий напылением.

5. Окрашивание Полу тонких срезов с Stain Ричардсона

  1. Давайте полу шлифах сухой на слайде.
  2. Пятно секций окрашивание раствора при 60 ° С в течение 1-2 мин.
  3. Стирать в дистиллированной воды.
  4. Сухой разделов и покровное.

6. Представитель Результаты

В человеческом маточных труб модель инфекции, мы смогли наглядно различия в морфологии эпителиальных между неинфицированных управления (рис. 1) и С. трахоматис - инфицированных трубы (рис. 2) при нормоксических состоянии. Характерные морфологические различия подразумевается патоген-индуцированного отека и лизис маточной трубе эпителиальных клеток, которые не могли быть обнаружены в неинфицированных управления. Использование полу тонких срезов и трансмиссионной электронной микроскопии, мы смогли доказать, внутриклеточный C. трахоматис включения образования в бывших естественных инфицированных человеческих тканей маточной трубы (рис. 3, 5), но не в неинфицированных управления (рис. 4). Как кислород концентрацииTIONS в женских половых путях уже низко в физиологических условиях 11, и дальнейшего снижения в течение воспалительного процесса мы также исследовали нашу модель в условиях гипоксии. Предварительные результаты показывают, модель полезна для анализа хламидийной роста и потомства при различных концентрациях кислорода. Chlamydia-индуцированного повреждения эпителия клетки должна быть отделена от артефактов, которые опосредованы через неосторожное подготовки и обработки маточных труб перед инфекцией (рис. 6).

figure-protocol-1
Рисунок 1. Сканирующей электронной микроскопии (SEM) из неинфицированных человека маточных через день инкубации в контрольной среде (зеленая стрелка показывает мерцательного клетку, синие стрелки показывают без ресничных клеток).

figure-protocol-2
Рисунок 2. Сканирование электронной микроскопии Копия (SEM) из бывших естественных хламидийной инфицированных человека маточной трубе в один прекрасный день после заражения (белые стрелки разрыва включение).

figure-protocol-3
Рисунок 3. Полу тонких срезов показывают типичный внутриклеточных включений (белые стрелки) 1d после заражения человека фаллопиевых труб с C. естественных трахоматис напр.

figure-protocol-4
Рисунок 4. Просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) в неинфицированных человека маточную трубу через день инкубации в контрольной среде.

figure-protocol-5
Рисунок 5. Просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) из бывших естественных C. трахоматис инфицированных человека маточной трубе в один прекрасный день после заражения (белые стрелки отмечают хламидийных включений).

ve_content "> figure-protocol-6
Рисунок 6. Сканирующей электронной микроскопии (SEM) маточных труб повреждения эпителия через неосторожное подготовки и обработки образца (белые стрелки знак разрушение эпителиальных тканей).

Обсуждение

Визуализация патоген-индуцированной вреда инфицированных тканей трудным и часто ограничивается экспериментальной процедуры на мышах. Мы создали модель распространения инфекции в бывших естественных условиях в человеческом маточных труб, чтобы проанализировать C. трахоматис инфекции верхних женских половых органов. С использованием этого метода, мы смогли визуализировать C. трахоматис - индуцированного повреждения эпителия человека маточных труб в течение одного дня после инфекции. Сотовые отек и лизис были характерны морфологические изменения, которые наблюдаются в С. трахоматис - инфицированных маточных труб, но не в неинфицированных управления. ТЕМ анализ показал, что хламидии реализовать типовую внутриклеточного цикла развития в инфицированных тканях, показывая большой включений с повторной дифференцированный элементарные тельца, но и меньше включений с увеличенными органами сетчатые, что может указывать на сохранение. Тем не менее, морфологическая картина сама по себе не достаточно, чтобы различать герicating и стойких инфекций, которые характеризуются снижением обмена веществ и повышенной устойчивостью к антибиотикам 10.

Разрушение эпителия маточных труб инфицированных либо в связи с нарушением C. трахоматис - инфицированных эпителиальных клеток после завершения внутриклеточный цикл развития и выпуска инфекционные элементарные тельца или освобождение провоспалительных цитокинов 8. Возбудитель-индуцированного повреждения тканей и хост-индуцированной иммунной реакции против C. трахоматис должны быть основные факторы, приводящие к потере эпителиального функции клеток, фибробластов реконструкции и, наконец, трубное бесплодие в естественных условиях 8,11.

Одним из основных ограничений этой модели является отсутствие воспалительных клеток, что затрудняет анализ вторичных эффектов на начальном C. трахоматис инфекции маточных труб эпителия. Тем не менее, модель APpropriate для изучения различных условиях окружающей среды (например, кислорода) и начальным принимающей иммунного ответа при острой C. трахоматис инфекций 8,9. Дальнейшие планы по созданию моделей для тестирования препаратов против C. инфекции у человека все фаллопиевых труб и для характеристики метаболического состояния разных стадиях развития наблюдается в трубной эпителия 2-фотонного микроскопа лазерного сканирования.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Эта работа выполнена при финансовой поддержке DFG-кластер Excellence "Воспаление в интерфейс" (RA-Если RA-D). Мы благодарны за отличную техническую помощь Кристин Wischnat.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Название реагента Компания Номер по каталогу Комментарии
DMEM ПАА E15-843
RPMI ПАА R15-802
ФТС ПАА A15-101
Циклогексимида Sigma - Aldrich
СПГ буфер различный см. рецепт ниже
Монти фиксатором различный см. рецепт ниже
буфера натрия какодилатном различный см. рецепт ниже
Richardson в пятно различный см. рецепт ниже

Рецепты:

1. СПГ буфер

  1. Добавить 75 г сахара.
  2. Добавить 2,47 г натрия фосфат.
  3. Добавить 0,36 г натрия фосфат.
  4. Добавить 0,72 г глутаминовой кислоты.
  5. Заполнить до 1 л дистиллированной воды с.
  6. Отрегулируйте рН до 7,3.

2. 0,1 М натрий какодилатном буфер, рН 7.35.

  1. Добавить 42,80 г dimethylarsenic натриевая соль.
  2. Добавить 68,46 г сахарозы.
  3. Заполнить до 1 л дистиллированной воды с. , чтобы получить 0,2 М натрий какодилатном буфера.
  4. Прежде чем использовать разбавленный раствор дистиллированной воды. до нужной концентрации и отрегулировать рН 7,35, если необходимо.

3. Монти фиксатором

  1. Добавить 156 мл 0.12 М натрий какодилатном буфера. 3,2 Добавить 25 мл 25% glutardialdehyde в дистиллированной воды.
  2. Добавить 19 мл10% параформальдегида в дистиллированной воды.
  3. Добавьте 3 мл 3% CaCl 2 в дистиллированной воды.
  4. Отрегулируйте рН 7.35 и заполнить дистиллированной воды. до 312 мл окончательного решения.

4. Ричардсон пятно

  1. Смешать равные части 1% метиленовым синим в 1% водный раствор буры и 1% Azur II в дистиллированной воды.

Ссылки

  1. Dean, D., Suchland, R. J., Stamm, W. E. Evidence for long-term cervical persistence of Chlamydia trachomatis by omp1 genotyping. J. Infect. Dis. 182, 909-916 (2000).
  2. Campbell, L. A., Patton, D. L., Moore, D. E., Cappuccio, A. L., Mueller, B. A., Wang, S. P. Detection of Chlamydia trachomatis deoxyribonucleic acid in women with tubal infertility. Fertil. Steril. 59, 45-50 (1993).
  3. Peipert, J. F. Clinical practice. Genital chlamydial infections. N. Engl. J. Med. 349, 2424-2430 (2003).
  4. Mardh, P. A. Tubal factor infertility, with special regard to chlamydial salpingitis. Curr. Opin. Infect. Dis. 17, 49-52 (2004).
  5. Ertel, A., Verghese, A., Byers, S. W., Ochs, M., Tozeren, A. Pathway-specific differences between tumor cell lines and normal and tumor tissue cells. Mol. Cancer. 5, 55(2006).
  6. Roshick, C., Wood, H., Caldwell, H. D., McClarty, G. Comparison of gamma interferon-mediated antichlamydial defense mechanisms in human and mouse cells. Infect. Immun. 74, 225-238 (2006).
  7. Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. J. Immunol. 172, 2731-2738 (2004).
  8. Hvid, M., Baczynska, A., Deleuran, B., Fedder, J., Knudsen, H. J., Christiansen, G., Birkelund, S. Interleukin-1 is the initiator of Fallopian tube destruction during Chlamydia trachomatis infection. Cell Microbiol. 9, 2795-2803 (2007).
  9. Roth, A., Konig, P., van, Z. G., Klinger, M., Hellwig-Burgel, T., Daubener, W., Bohlmann, M. K., Rupp, J. Hypoxia abrogates antichlamydial properties of IFN-gamma in human fallopian tube cells in vitro and ex vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 19502-19507 (2010).
  10. Wyrick, P. B., Knight, S. T. Pre-exposure of infected human endometrial epithelial cells to penicillin in vitro renders Chlamydia trachomatis refractory to azithromycin. J. Antimicrob. Chemother. 54, 79-85 (2004).
  11. Van Voorhis, W. C., Barrett, L. K., Sweeney, Y. T., Kuo, C. C., Patton, D. L. Repeated Chlamydia trachomatis infection of Macaca nemestrina fallopian tubes produces a Th1-like cytokine response associated with fibrosis and scarring. Infect. Immun. 65, 2175-2182 (1997).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Chlamydia trachomatisex vivo

Похожие статьи