Авторы не имеют конфликтов интересов, подлежащих раскрытию.

РНК Извлечение из neuroprecursor ячеек с использованием bio-rad Всего РНК kit

РНК Извлечение из Neuroprecursor ячеек с использованием Bio-Rad Всего РНК Kit

Здравствуйте, я Джош Ш., аспирант лаборатории доктора Эда Маки в Калифорнийском университете в Ирвайне. Я покажу вам, как выделить RNA из нейрональных клеток-предшественников с помощью набора BioRad to RNA mini kit. Я использую этот набор в нашей лаборатории уже несколько лет, и он всегда обеспечивает стабильные результаты с высоким выходом продукта.Для работы мы используем нейрональные клетки-предшественники на стадии E14.5, которые были подвергнуты острому диссоциированию из эмбриональных кортексов; обычно мы высеваем их в 24-луночный планшет для культивирования тканей с покрытием из поли-D-лизина и ламинатина, используя плотность посева 100 000 клеток на лунку. Прежде чем начать, должен сообщить, что работать следует на специально отведенном лабораторном столе для работы с РНК. Прежде всего необходимо убедиться, что стол для работы с РНК чист.Для надлежащей очистки рабочей поверхности следует использовать средство RNA zap. По сути, оно уничтожает все остатки РНК, поскольку этот реагент эффективно разрушает молекулы РНК. Также необходимо всегда работать в перчатках при проведении экстракции, так как кожа человека содержит большое количество таких РНК.Таким образом, этого делать категорически нельзя. Итак, у меня здесь набор BioRad total RA mini kit. Я извлек его содержимое, поэтому позвольте мне показать вам, что в него входит.Прежде всего, у нас есть PBS, обработанный X dep C, и 70% этанол, обработанный DEP. У нас есть раствор для лицензирования тотальной РНК, в который был добавлен этанол Dan me capital. Вторым является промывочный раствор низкой строгости с добавлением 100% этанола, промывочный раствор высокой строгости, раствор для разведения ДНК, сама ДНК и элюат тотальной РНК.Затем раствор помещают в термоблок, нагретый до 70 °C. Также нам понадобятся пробирки объемом 1,5 мл с крышками. Убедитесь, что используемые пробирки не содержат ДНК или РНК.Также у нас есть две пробирки без крышки объемом 2 мл. Но самое главное — это сами колонки для выделения RNA. Без них проведение экстракции RNA невозможно.Таким образом, для сборки этих колонок вам понадобится колонка для РНК и колпачок объемом 2 мл без прокладки; просто соедините их, и всё будет готово к работе. Итак, последнее, что нам всегда необходимо, — это клетки. В данном случае используются нейральные предшественники из линии Eton 1.5.Клетки были подвергнуты острому диссоциированию из эмбриональной коры. В течение нескольких дней они культивировались в среде DMEM. Я извлек клетки из инкубатора, установленного на 37 °C.Данный протокол предназначен для адгезивных клеток. Эти клетки выращивали на 0,4-луночных планшетах для культивирования тканей, имеющих покрытие из PDL и ламинатина. Теперь я возьму вакуумный аспиратор и удалю среду.Следующим шагом необходимо добавить около 500 µL депилетированного PBS с SEA. Здесь мы снова используем фильтрующие наконечники. PBS в данном случае служит для того, чтобы вымыть остатки среды.Таким образом, необходимо избегать попадания компонентов среды в колонку для выделения РНК или любого вмешательства в процесс экстракции РНК, иначе вы не получите хороший выход. Хорошо? Теперь я быстро аспирирую PBS, так как нейральные стволовые клетки плохо переносят PBS. Теперь я добавлю по 350 µL лизирующего буфера в каждый образец.Итак, убедитесь, что вы добавили β-меркаптоэтанол в лизирующий буфер. Теперь я 15 раз перемешаю лизирующий буфер с помощью пипетки, чтобы убедиться в полном лизисе клеток для извлечения содержимого РНК.Теперь я добавлю 70% деэтилированный этанол в каждую лунку. После добавления 350 µl этого 70% деэтилированного этанола я выполню перемешивание путем десятикратного аспирирования и dispensed из каждой лунки. Я повторил эту процедуру 10 раз для каждой лунки. Теперь я установлю объем на дозаторе более 700 µl, так как общий объем каждой лунки составляет 700 µl.Затем я перенесу объем жидкости более 700 µL в колонку для выделения РНК. После добавления содержимого в колонку я помещу её в центрифугу и буду центрифугировать в течение 30 секунд на максимальной скорости. После первого центрифугирования лизата я удалю фильтрат, слив его в пустой контейнер.Также некоторые используют вакуумный шланг, чтобы отсосать фильтрат. Далее добавьте 700 µL буфера для промывки с низкой строгостью. И снова убедитесь, что вы добавили в него этанол.Теперь я центрифугирую образец в течение 30 секунд на максимальной скорости. После центрифугирования с буфером для промывки с низкой строгостью я удалю фильтрат. Хорошо? Затем я приготовлю раствор ДНК.Таким образом, в каждый образец необходимо добавить 5 µL ДНК. Мы заранее разделяем ДНК на аликвоты перед началом работы, так как это фермент.Рекомендуется хранить их в виде аликвот. При хранении в одном общем объеме циклы замораживания и оттаивания приведут к потере ферментативной активности. Поэтому после добавления 5 µL ДНК я разбавлю её 75 µL раствора для разведения ДНК.После добавления этого компонента общий объем раствора ДНК составит 80 мкл. Теперь я добавлю по 80 мкл раствора ДНК в каждый образец. Убедитесь, что раствор попал непосредственно на мембрану колонки.Таким образом, раствор ДНК должен пропитать мембрану. Это позволит удалить ДНК и тем самым увеличить выход РНК.После добавления ДНК оставьте колонку на 15 минут при комнатной температуре, чтобы фермент мог подействовать. Таким образом, инкубация продлится 15 минут. Итак, время вышло.После 15-минутной инкубации я помещу образцы в центрифугу и буду осаждать ДНК в течение 30 секунд при максимальной скорости. После центрифугирования в течение 30 секунд для осаждения ДНК я удалю фильтрат. Теперь я добавлю 700 µL буфера высокой строгости, чтобы вымыть остатки ДНК.Затем, после добавления, я снова центрифугирую пробу в течение 30 секунд. После центрифугирования я удалю фильтрат с высокой степенью строгости, просто слив его в контейнер. Затем мы добавим 700 µL буфера с низкой степенью строгости.Теперь я центрифугирую образец в течение одной минуты на максимальной скорости в Centri Beach. После первого минутного промывания с низкой строгостью я удалю фильтрат. В этот раз я ничего не буду добавлять, но снова центрифугирую образец в течение двух минут, чтобы избавиться от остатков буфера для промывки с низкой строгостью, поскольку он содержит этанол, который может снизить выход РНК.Теперь я достану буфер для элюции из термоблока с температурой 70 °C. Напоминаю: перед началом эксперимента убедитесь, что буфер для элюции нагрет до 70 °C; необходимо поддерживать его в теплом состоянии, чтобы повысить эффективность выхода РНК. Колонки у меня готовы.Их центрифугировали. Теперь переходим к следующим шагам: извлекаем колонки. Хорошо, я выброшу эти пробирки с крышками и перенесу их в эти пробирки с крышками.Добавьте по 50 µL буфера Lucian в каждую колонку. Убедитесь, что буфер попал на мембрану и полностью ее пропитал. В противном случае выход РНК будет низким.Теперь оставьте колонку на одну или две минуты, чтобы элюат полностью пропитала мембрана колонки. Прошла одна минута. Теперь колонку можно перенести в центрифугу.Теперь я помещу колонки в центрифугу. Я буду центрифугировать их в течение одной минуты на максимальной скорости. Это последний этап центрифугирования, по завершении которого вы соберете элюат с загрязняющим веществом или РНК в эти пробирки с крышками.Теперь, после последнего центрифугирования, извлеките содержимое, снимите колонку (ее можно утилизировать), закройте пробирку; теперь образцы можно хранить при температуре -80 °C и использовать их далее по своему усмотрению. Таким образом, я выделил RNA с помощью набора BioRad RNA kit. Теперь я измерю концентрацию выделенной RNA или определю ее OD с помощью спектрофотометра.Итак, я покажу вам следующее. Сначала нам необходимо приготовить разведения. Мы будем делать разведение 1 к 5.Мы смешаем нашу РНК с фильтрованной молекулярно-биологической водой. Сначала я приготовлю холостую пробу. Для этого я возьму 2 µL раствора для элюции, который использовался для элюции РНК на начальном этапе, и добавлю 8 µL молекулярной воды. Хорошо?Итак, это наш холостой образец. Теперь я подготовлю исследуемый образец. Нам потребуется 2 µL нашей целевой RNA.Мы снова добавим 8 µL воды MQ. Таким образом, получится разведение 1 к 5, верно? У меня есть эта кювета, в которую я помещу свои образцы, а затем установлю эту кювету в спектрометр.Теперь приступим к измерениям. Прежде чем измерить OD образцов РНК, мне необходимо очистить кювету. Итак, перед нами стеклянная кювета.Ни в коем случае не прикасайтесь к его передней части. В противном случае на ней останутся отпечатки, и я получу неверные измерения. Поэтому первым делом я промою стеклекювет водой с двойной дистилляцией.Затем я возьму вакуумный шланг и откачаю воду. После этой промывки я промою образец 95% ethanol, а затем снова воспользуюсь вакуумным шлангом, чтобы удалить ethanol.Теперь я готов загрузить холостую пробу. Прежде всего нам необходима холостая проба для нормализации показаний. Я возьму 10 µL смеси, которую мы только что приготовили.Теперь я перемешаю раствор, чтобы добиться однородности. Затем я перенесу его на спектрофотометр. Это прибор Ultra Spec 3, 100 probe, с помощью которого мы измерим концентрацию РНК.Откройте прибор и поместите образец в один из этих держателей. Мы настроим программу так, чтобы считывалась только РНК. Итак, повторим: мы провели разведение 1 к 5.Итак, мы хотим установить коэффициент разведения равным пяти. Хорошо, я готов. Теперь я нажму «run» (запуск), чтобы провести измерение холостой пробы.Хорошо, теперь прибор обнулен. Теперь мы готовы измерить наш образец. Я вынимаю стеклянную кювету.Я удалю содержимое холостой пробы. Затем я повторно промою её дважды дистиллированной водой. После этого я промою её 5% этанолом девять раз.Теперь я готов внести 10 µL нашего исследуемого образца. Итак, еще раз убедитесь, что вы перемешали образец. Теперь внесем его в стеклянную кювету.Теперь мы готовы к считыванию данных. После измерения плотности OD, показатели хорошего выхода и чистоты должны быть следующими: соотношение абсорбции РНК 260/280 должно быть около 2, а выход составляет примерно 144 µg/ml.Несмотря на то что прибор показывает 72 micrograms per mil, нам необходимо умножить это значение на два из-за половинной длины в наших ветах, два сантиметра. Мы продемонстрировали вам, как экстрагировать RNA из нейропрекурсорных клеток. Снова мы используем набор total mini RNA kit от BioRad. Мы перепробовали другие наборы, и этот оказался лучшим с точки зрения эффективности.Это позволяет получить РНК высокого качества. При использовании данного набора вы получите такие же качественные результаты, которые мы получаем всегда.

РНК Извлечение из Neuroprecursor ячеек с использованием Bio-Rad Всего РНК Kit

В этой статье

Раскрытие информации

Перепечатки и разрешения

Теги

Похожие статьи