Определение белковых комплексов в Кишечной палочки С помощью последовательного аффинной очистки пептидов в сочетании с тандемной масс-спектрометрии

Summary

Affinity очистки меченых белков в сочетании с масс-спектрометрии (ППМ) является мощным методом для систематического отображения сети взаимодействия белка и для исследования механистической основе биологических процессов. Здесь мы описываем оптимизированный последовательных пептидов близости (SPA) ППМ процедуры, разработанные для бактерии Кишечной палочки, Который может быть использован для выделения и характеризуют стабильное мульти-белковых комплексов почти до однородности, даже начиная с низким числом копий на клетку.

Abstract

Поскольку большинство клеточных процессов опосредованы макромолекулярными ансамблями, систематическая идентификация белок-белковых взаимодействий (ИПП) и идентификация субъединичного состава мультибелковых комплексов может дать представление о функции генов и улучшить понимание биологических систем^{1, 2}. Физические взаимодействия могут быть картированы с высокой степенью достоверности путем крупномасштабной изоляции и характеризации эндогенных белковых комплексов в условиях, близких к физиологическим, на основе аффинной очистки хромосомно меченых белков в сочетании с масс-спектрометрией (APMS). Этот подход был успешно применен к эволюционно разнообразным организмам, включая дрожжи, мух, червей, клетки млекопитающих и бактерии^1-6. В частности, мы создали карбокси-концевую систему последовательного пептидного аффинизма (SPA) для очищающих аффинность нативных белковых комплексов из культивируемых грамотрицательных Escherichia coli, используя генетически управляемые лабораторные штаммы хозяина, которые хорошо подходят для полногеномных исследований фундаментальной биологии и консервативных процессов прокариот^{1, 2, 7}. Наша система SPA-мечения аналогична тандемному методу аффинной очистки, первоначально разработанному для дрожжей^{8, 9}, и состоит из пептида, связывающего кальмодулин (CBP), за которым следует сайт расщепления высокоспецифичной протеазы вируса этирования табака (TEV) и трех копий эпитопа FLAG (3X FLAG), что позволяет провести два последовательных раунда аффинного обогащения. После кассетной амплификации секвенционно-специфичные продукты линейной ПЦР, кодирующие SPA-метку и выбираемый маркер, интегрируются и экспрессируются в кадре в виде карбокси-концевых слияний на фоне DY330, который индуцируется для временной экспрессии высокоэффективной гетерологичной системы рекомбинации бактериофага¹⁰. Последующая двухступенчатая очистка с использованием кальмодулина и аффинных гранул anti-FLAG позволяет высокоселективно и эффективно восстанавливать даже белковые комплексы с низким содержанием из крупномасштабных культур. Затем с помощью тандемной масс-спектрометрии можно идентифицировать стабильно соочищающиеся белки с высокой чувствительностью (низкие пределы обнаружения нанограммов).

Здесь мы описываем подробные пошаговые процедуры, которые мы обычно используем для систематического мечения белков, очистки и анализа растворимых белковых комплексов из E. coli, которые могут быть масштабированы и потенциально адаптированы к другим видам бактерий, включая определенные условно-патогенные микроорганизмы, которые поддаются рекомбинации. Результирующие физические взаимодействия часто могут выявить интересные неожиданные компоненты и связи, предполагающие новые механистические связи. Интеграция данных ИПП с данными об альтернативных молекулярных ассоциациях, такими как генетические (ген-генные) взаимодействия и прогнозы геномного контекста (ГК), может облегчить выяснение глобальной молекулярной организации мультибелковых комплексов в биологических путях. Сети, созданные для E. coli, могут быть использованы для получения представления о функциональной архитектуре ортологичных продуктов генов у других микробов, для которых функциональные аннотации в настоящее время отсутствуют.

Protocol

1. Строительство ген-специфического SPA-пометки в E. Штамм кишечной DY330

1. Плазмиды pJL148 охватывает SPA-теги последовательности ДНК и канамицин антибиотиков кассеты маркер устойчивости (Кан ^R) используется в качестве матрицы в полимеразной цепной реакции (ПЦР) ^7. 45 нуклеотидов гена конкретных прямой праймер, расположенный непосредственно перед остановкой целевого гена кодон в рамке с 27 б.п. ('5'-AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3) теги конкретных прямого праймера, и в 45 нуклеотидов генов конкретного обратный праймер, расположенный сразу вниз по течению от остановки целевого гена кодон в рамке с 27 б.п. (5'-GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT -3 ') тег специфического праймера обратного, используется для усиления SPA-теги и Кан ^R кассету из pJL148, используя следующие велосипедные Условия ПЦР: 94 ° C в течение 5 мин, 30 циклов при 94 ° C в течение 1 мин, 55 ° C в течение 1 мин, 68 ° С в течение 2 мин 10 сек, а затем 68 ° С в течение 10 мин. Эти усиленные последовательности служитьс субстратом для эктопически введен λ-красный гомологичной рекомбинации техники (см. ниже).
2. ПЦР-продукт очищают с использованием очистки QIAquick ПЦР комплект для удаления солей, которые могут помешать электропорации. Очищенный продукт ПЦР в дальнейшем направлены на интеграцию в конце 3 '(непосредственно перед родной стоп-кодон) конкретного гена в DY330 штамм, в котором λ-красный рекомбинации техники выражается ^10.
3. DY330 λ-красный выражения штамм выращивают в течение ночи в 2 мл Лурия-Bertani (LB) среде при 32 ° C при встряхивании при 180 оборотах в минуту. 1 мл ночной культуры в дальнейшем вносили в 70 мл свежей среды LB в 500 мл коническую колбу. Посевной выращивают при 32 ° C при встряхивании на 180 оборотов в минуту до OD ₆₀₀ достигает ~ 0,8.
4. Культуры переносят в свежий 250 мл коническую колбу, в которой клетки индуцированные инкубирования колбу в водяную баню при 42 ° C, осторожно встряхивая при180 оборотов в минуту в течение 15 мин. Сразу же после индукции, колбы инкубируют в суспензии бане с ледяной водой в течение не менее 30 мин при встряхивании.
5. Ледяной культуры немедленно переносится в предварительно охлажденный трубы полипропиленовые 50 мл и подвергали центрифугирования при 3993 х г в течение 6 мин при 4 ° C. Осадок клеток суспендируют в 50 мл ледяного стерильной водой и центрифугируют еще раз в 3993 мкг в течение 6 мин при 4 ° C. Осадок клеток ресуспендируют в 1 мл холодной воды и переносят в 1,5 мл трубки Effendorf, и центрифугировали при максимальной скорости в течение 20 секунд при 4 ° C. После двух или трех этапов промывки с ледяной водой, осадок клеток ресуспендируют, наконец, в 700 мкл ледяной стерильной воды, в результате электро-компетентных клеток.
6. С помощью электропорации, один мкл ампликонов очищенный вводят в 40 мкл электро-компетентных клеток. Клетки электропорации в Bio-Rad GenePulser II со следующими настройками: 2,5 кВ, 25 мкФ с импульснымКонтроллер на 200 Ω. После гомологичной рекомбинации и интеграции, трансформанты, которые успешно рекомбинируют тег / кассеты в хромосому выбирается в зависимости от сопротивления Кан (рис. 1А). Несколько трансформанты отбирают для вестерн-блоттинга, чтобы проверить правильность поколения (т.е. положительный сигнал) СПА-меченных белков слияния с анти-FLAG M2 антитела, которые избирательно против FLAG эпитопов SPA-тегов.
7. Подтверждено карбокси терминала SPA-теги слияния штамм культивировали на крупномасштабные, чтобы изолировать растворимые комплексы белка из собранных клеток с использованием протокола SPA очистки. Схема этапов процедуры очистки тегу сродство показано на рисунке 1b.

2. Культивирование и Озвучивание

1. Инокуляции 100 мкл SPA-отмеченных E. палочки глицерина акций в 50 мл бульона потрясающий (ТБ) жидкой среде, дополненной 50 мкл 25 мкг / мл оF Кан решения в 250 мл коническую колбу. Рост культуры в течение ночи при 32 ° C.
   Примечание: Так как температура индуцируемых λ Красной кассету в штамм DY330 находится под контролем чувствительных к температуре репрессор ^10, SPA-отмеченных штамма E.coli выращивают при температуре 32 ° C.
2. Передача 10 мл ночной культуры в 990 мл свежего ТБ с добавлением 25 мкг / мл Кан в 4-литровую колбу. Культуру выращивают при температуре 32 ° C с постоянной тряски при 250 оборотах в минуту, от 5 до 6 часов, пока OD ₆₀₀ достигает ~ 2 до 3.
3. Передача 1 литр E. палочки SPA-теги культуры для очистки центрифугированием бутылки и спина клеток при 4 ° С в Beckman J6-HC центрифуги @ 3993 х г в течение 15 мин.
4. Супернатант удаляют из бутылки центрифугирования. Ресуспендируют E. кишечной клетки окатышей с 25 мл ультразвуком буфера. Обеспечить, чтобы сохранить центрифугирования бутылки на лед во все времена.
5. Ресуспендированный осадок являетсяпередано 50 мл трубки сокола полипропилена и замораживают с использованием жидкого азота. Замороженных клеток хранится при температуре -80 ° С в течение длительного использования.
6. Перед обработкой ультразвуком, оттаивать замороженные клетки полностью, сохраняя окатышей на льду. Талых образцы переносят в стерильную чашку из нержавеющей стали помещают на лед для обработки ультразвуком. Зонд погружается в образец и обрабатывали ультразвуком в течение 3 мин. Дополнительные 2 мин охлаждают образца от перегрева.
7. Ультразвуком клеточный лизат переносится в предварительно охлажденный стерильную пробирку центрифугированием и подвергали центрифугированием при 4 ° С в центрифуге Beckman использованием JA-17 ротор @ 35267 мкг (16.000 оборотов в минуту) в течение 15 мин дважды.
   Примечание: В случае мембранной очистки белков, ультразвуком клеточный лизат центрифугируют только один раз в течение 15 минут, потому что мы не знаем, в которых доля мембранных белков, то есть либо в гранулах или в надосадочной фракции. Таким образом, чтобы избежать лишних потерь сувенирыбранные белки, мы вращаем клетки в течение 15 мин на высокой скорости центрифугирования и супернатант затем обрабатываются для очистки (см. ниже), где 1% моющего средства для растворения мембранных белков.
8. Супернатант от центрифугирования трубку осторожно переносят в 50 мл трубки сокола полипропилена и замораживают с использованием жидкого азота. Ультразвуком замороженного клеточного экстракта сохраняется в течение не более 6 месяцев при температуре -80 ° C для дальнейшего использования.

3. Аффинной очистки

1. Перед использованием 100 мкл Anti-Flag M2 бисер омывается 10 томов АФК буфера (30 мМ Трис-HCl, 150 мМ NaCl, 0,1% моющего средства, и 0.1-0.5 мМ TCEP [трис (2-карбоксиэтил) фосфин - соляная кислота]) без моющих средств и восстановителя TCEP (трис (2-карбоксиэтил) фосфин).
2. Замороженные, ультразвуком клеточного экстракта размораживают путем размещения трубы в холодной воде. Талых клеточный экстракт инкубируют с 3 мкл бензNase нуклеазы в течение 30 мин при 4 ° C. К этой смеси добавить неионных моющих средств Triton X-100 (конечная концентрация моющего средства должна быть 0,1%) и 200 мкл суспензии Anti-Flag M2 бисером агарозы.
   Примечание: Для всех растворимых очищения белка, 0,1% Triton X-100 используется для минимизации неспецифической адсорбции, где, как для очистки мембранного белка, различные мягкие неионных детергентов, таких как C12E8 (Octaethylene эфире додецилсульфата гликоль), DDM ( н-додецил β-D-maltoside) и мальтоза-неопентилгликоля (MNG) могут быть использованы на 1% моющего средства для повышения концентрации солюбилизации. Так как различные моющие средства имеют различную эффективность солюбилизации мембранных белков, рекомендуется выполнять независимые очищения белка использовании более одного моющего средства.
3. Содержание осторожно перемешивают, вращая трубку в течение 3 ч при температуре 4 ° С с использованием LabQuake шейкере. Через 3 часа вращения, трубки центрифугируют при 1700 х г в течение 6 мин. Супернатант то гemoved тщательно, насколько это возможно, не нарушая свободную борта гранул.
4. Осадок суспендируют в остальных супернатанта, а затем переносят в 0,8 х 4 см Bio-Rad колонке полипропилена преп. Обеспечить, чтобы снять нижнюю пробки выходе из колонки, чтобы элюатов для слива самотеком. Промойте колонку 5 раз TEV шаг расщепления.
5. После слива промытый элюатов, нижняя выходе из колонки закрыт. К этой же колонке, расщепление осуществляется путем добавления ~ 5 до 10 мкл (50 единиц) TEV протеазы и 400 мкл буфера 1X АФК на колонку. Обеспечить, чтобы закрыть верхнюю часть колонны с крышкой. Колонка, содержащая гранулы поворачивается мягко ночи при 4 ° С в течение ночи помощью LabQuake шейкере.
6. Снимите крышку на верхней и выходе пробку в нижней части колонны, и слейте элюатов восстановился после расщепления TEV в свежую колонку, содержащую 200 мкл суспензии кальмодулин-сефарозе бисером, который промывают на 10Объемы кальмодулин связывающего буфера.
7. Оба верхней и нижней части колонны крепятся плотно, и содержимое в колонке смешиваются осторожно вращая в течение 3 ч при температуре 4 ° С с использованием LabQuake шейкере.
8. Через 3 часа вращения, элюата сливают, удалив верхнюю крышку и нижнюю пробку колонны. Колонку промывают четыре раза 200 мкл 1X кальмодулин буфера для связывания следуют один строгий мыть с 400 мкл промывочного буфера кальмодулина.
9. Связанного белка вымывается в четырех фракций 50 мкл в новую пробирку Eppendorf использованием 1X кальмодулин элюции буфером. Элюированную фракции распространяется в двух чистые трубы Эппендорф в равных объемах. Обе трубы сушат использованием скорости вакуум.
10. Высушенные элюата из одной трубки используется для запуска гель окрашивания серебром, а другой хранится в -80 ° C, перед использованием масс-спектрометрии.

4. Окрашиванием серебром

1. Для серебра stainiнг, половина объема 3X SDS (сульфат натрия додецилсульфата) буфера для образца добавляют 50 мл сухого элюата. После кипячения смесь в течение 5 мин, образцы загружают в полиакриламидном геле SDS.
2. После того, как гель завершения работы, он осторожно положил в фиксирующем растворе (50% метанола и 10%-ной уксусной кислоты) и перемешивают осторожно на ротационном шейкере в течение 20 мин. Гель затем промыть в 20% этаноле в течение 10 мин.
3. Фиксированные гель тщательно промывают два раза по 500 мл дважды дистиллированной воде в течение 10 мин, чтобы обеспечить низкий фон форма.
4. Гель затем перемешивают осторожно в 500 мл натрия тиосульфат в течение 1 мин, затем две стадии промывки дистиллированной водой в течение 20 сек.
5. Вода сбрасывается, и гель инкубируют в 200 мл 0,1% раствора нитрата серебра в течение 30 мин. После этого времени, нитрат серебра удаляют, а гель промывают дистиллированной воды в течение 20 секунд, чтобы удалить избыток нитрата серебра.
6. Гель, наконец, ручной перемешивают в 75 млразвивающейся решение. Когда желаемая интенсивность достигается, развивающиеся решение отбрасывается и 80 мл уксусной кислоты добавляют, чтобы остановить реакцию. Обеспечить для инкубации гель в уксусной кислоте в течение как минимум 20 минут для правильной визуализации геля полосы.

5. Протеолиз и подготовки проб для масс-спектрометрии

1. Для высушенного образца, добавить 50 мкл буфера пищеварения и 0,9 мкл 100 мМ TCEP-HCl (трис (2-карбоксиэтил) фосфин - соляная кислота) и инкубируют смесь в течение 45 мин при комнатной температуре для уменьшения шага. Далее, 1 мкл 500 мМ иодацетамида и инкубируют в темноте в течение еще 40 минут, чтобы позволить образца алкилирования.
2. После второго раунда инкубации, добавьте 1 мкг иммобилизованным трипсином к смеси и инкубировать либо при 37 ° C в течение 5 часов или на ночь при комнатной температуре. Обеспечить, чтобы остановить реакцию добавлением 1 мкл уксусной кислоты.
3. Предварительно мокрой MillipoRe Zip-Tip пипетки путем аспирации 10 мкл смачивания и уравновешивания раствора. Внесите решение впустую. Впоследствии аспирации 10 мкл моющего раствора и отказаться от решения впустую. Повторите этот шаг дважды.
4. Для эффективного связывания пептида смесь до кончика, пипетки перемешать смесь пептидов в 20 раз. Смесь пептидов, которые присоединились к кончику смывается аспирации и дозирования моющего раствора. Повторите эту процедуру дважды для эффективного связывания пептида смеси чаевых.
5. С кончика содержащие связанный пептид, аспирацию 10 мкл смачивания и уравновешивания решение, и обойтись в чистую пробирку Эппендорф. Повторите этот шаг в два раза. После высыхания Элюированную образцов в скорости вакуум, образцы могут быть проанализированы сразу же методом масс-спектрометрии или хранится при температуре -80 ° C до использования.

6. Идентификации белков по LTQ Orbitrap Velos Масс-спектрометр

Thэлектронной полипептидных компонентов изолированные комплексы идентифицируются с помощью Orbitrap LTQ Velos гибридных тандемной масс-спектрометра. Orbitrap имеет исключительное разрешающей способностью (> 60000 Полная максимальная полуширина или FWHM) и масс точностью (<2 частей на миллион), что сводит к минимуму MS / MS выборки не имеет значения неспецифический фон загрязнения обнаружены в управление очищений, в то время как высокая скорость Velos ионной ловушкой компонент можно обнаружить и фрагмент низким пептиды изобилия, используя как перенос электронов диссоциации и индуцированных столкновениями диссоциации режимах. Высокая матчей доверия между результатом MS / MS спектры сопоставлены с ссылкой E. последовательностей белков палочка с помощью алгоритма поиска в базе данных, как SEQUEST и каждой соответствующей последовательности рассмотрен во время вероятность алгоритм, как STATQUEST ^11. Общее количество спектров пептидов уникальность последовательность и общих загрязнений фона обнаружено в отрицательном контроле (то есть. Макет) очищений считаются для достижения низкой эмпирической ложно-дисплееоткрытием курс. Следующие шаги выполняются для идентификации белков:

1. Микро-колонны упакованы с ~ 10 см 3 мкм Luna-C ₁₈ смолой и сопряжены с ионом Proxeon nanoelectrospray источника, который находится в соответствии с Orbitrap инструмента.
2. Поток двоичных Proxeon нано HPLC насоса используются, чтобы предоставить стабильную скорость потока оконечности п ~ 300 мин ^-1 в течение пептида увольнений.
3. Для достижения пептида элюирования органических градиент буфера устанавливается в соответствии с образцом сложности. Например, следующий градиент, как правило, созданы для E. палочки SPA образцов: растворитель B увеличен с 2% до 6% в 1 мин, до 24% в 38 мин, до 100% в следующие 4 мин, состоявшегося на 100% в течение 1 мин, затем снизились до 2% в 1 мин, и окончательное держать на уровне 2% в течение 15 мин. Подвижная фаза растворителя имеет 95% ВЭЖХ градиент воды и 5% ACN с 0,1% муравьиной кислоты, в то время как растворитель B имеет 5% ВЭЖХ градиент воды и 95% ACN с 0,1% муравьиной ациD. Расход на кончике иглы установлено до 300 NL мин ^-1 в течение 60 мин.
4. Когда масса циклов спектрометра работать через одну полную проверку массы в 60000 резолюций, 10 сопутствующих сканирование фрагментация тандемной масс собираются для наиболее интенсивные ионы предшественника. Динамические исключения, моноизотопном выбор массы и данных в реальном времени зависит от особенностей приобретения инструмент включен.
5. Спектры поиск с использованием алгоритма поиска в базах данных, таких как SEQUEST по базе данных E. палочки белковых последовательностей, и результат статистически фильтровали с использованием алгоритма вероятность таких как STAQUEST ¹¹ по обеспечению низкий уровень ложных открытий. Только высокое доверие (99% вероятности) кандидаты отбираются, в то время матчей показывать более 10 млн массу ошибки по сравнению с теоретической массы пептида исключается из дальнейшего рассмотрения.

Results

После того, как помеченные белки приманки, которые экспрессируются на эндогенных уровнях, аффинно очищаются из культур логарифмической фазы, образцы были помещены на гель с серебряным окрашиванием для визуализации отдельных полипептидных компонентов выделенных стабильных комплексов. Мы также подвергли вторую порцию очищенных аффинностью образцов белка безгелевой тандемной масс-спектрометрии (LCMS) для идентификации соответствующих полипептидных последовательностей. Эффективность этой процедуры APMS показана с помощью реп...

Discussion

Ключевым аспектом SPA-подхода ППМ описано здесь является то, что пометки осуществляется в пределах естественной хромосомной контексте, обеспечивая тем самым нормальное регулирование генов сохраняется (то есть. Родной промоутер приманки сохранились, следовательно, уровни экспрессии не возмущается) и родным стабильно связанного белковых комплексов будут восстановлены в ближайшее эндогенного уровня. Вопросы Operon полярности также избежать, в том числе внешне ориентированной промоутер в селективного маркера. Этот ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
I. Антибиотики
Kanamycin	Bioshop	#KAN201
Ampicillin	Bioshop	#AMP201
2. Terrific-Broth medium
Bio-Tryptone	Bioshop	#TRP 402
Экстракт дрожжей	Bioshop	#YEX 555
Глицерин	Bioshop	#GLY 002
K2HPO4	Bioshop	#PPM 302
KH2PO4	Bioshop	#PPM 303
3. Штамм бактерий и Plasmid
DY330		Yu et al. (2000)10
pJL148		Zeghouf et al. (2004)7
4. Реагенты для ПЦР и электрофореза
Taq ДНК-полимераза	Fermentas	# EP0281
10 X PCR буфер	Fermentas	# EP0281
10 mM dNTPs	Fermentas	# EP0281
25 mM MgCl2	Fermentas	# EP0281
Agarose	Bioshop	# AGA002
Загрузка краситель	NEB
Бромид этидия	Bioshop	# ETB444
10X TBE буфер	Thermo Scientific	#28355
Tris Base	Bioshop	#TRS001
Борная кислота	Bioshop	#BOR001
0,5 М ЭДТА (pH 8,0)	Sigma	# E6768
ДНК-лестница	NEB	#N3232L
5. Наборы для выделения плазмид и очистки
Plasmid Midi kit	Qiagen	#12143
QIAquick PCR purification Kit	Qiagen	#28104
6. Оборудование для ПЦР и трансформации
Thermal Cycler	BioRad	iCycler
Agarose гель электрофорез	BioRad
Electroporator	Bio-Rad	GenePulser II
0,2 см Электропорация	Bio-Rad
42 ° C шейкер с водяной баней	Innova 3100
C Shaker	New Brunswick Scientific, США
32 ° C большой шейкер	Нью-Брансуик Scientific, США
32 ° Инкубатор с C пластиной	Fisher Scientific
7. Электрофорез и вестерн-блоттинг
Акриламидный мономер, N,N'-метиленбис-акриламид	Bio-Rad	#161-0125
Персульфат аммония	Bioshop	# AMP001
n-бутанол	Sigma	# B7906
TEMED	Bioshop	#TEM001
Ватман No1 фильтровальная бумага	Fischer Scientific	#09-806A
Мини протеан 3 клетки	Bio-Rad	# 165-3301
Устройство для переноса геля iBlot	Invitrogen	#IB1001
Нитроцеллюлозные мембраны	Bio-Rad	# 162-0115
Моноклональное антитело Anti-Flag	M2 Sigma	#F3165
Пероксидаза хрена	Амершам	#NA931V
Предварительно окрашенный стандарты молекулярной массы белка	Bio-Rad	#161-0363
Хемилюминесцентный реактив	PIERCE	#1856136
Авторадиографическая пленка	Clonex Corp	#CLEC810
промокательная бумага Quick Draw	Sigma	#P7796
платформа C2 качалка	New Brunswick Scientific, США
<стронг>8. Sonication Equipment and Reagents
Sonicator	Branson Ultrasonic	#23395
NaCl	Bioshop	#SOD001
Ингибиторы протеазы	Roche	#800-363-5887
0,5 мМ TCEP-HCl	Thermo Scientific	#20490
9. Affinity Purification Реагенты и оборудование
0,8 x 4 см Полипропиленовая колонка	Bio-Rad Bio-Rad	#732-6008
Бензоназа нуклеаза	Novagen	#70746
Anti-FLAG M2 агарозные шарики	Sigma	#A2220
кальмодулин-сефарозные шарики	GE Healthcare	#17-0529-01
TEV протеаза	Invitrogen		Triton
X-100	Sigma	#T9284
CaCl2	Sigma	#C2661
EGTA	Sigma	#E3889
LabQuake Shaker	Thermolyne	#59558
10. Реагенты для окрашивания серебра
Метанол	Bioshop	#MET302
Уксусная кислота		Bioshop t#ACE222
Тиосульфат натрия	Sigma	#S-7143
Нитрат серебра	Fischer Scientific	#S181-100
Формальдегид	Bioshop	#FOR201
Карбонат	натрияBioshop	#SOC512
11. Реагенты и оборудование для идентификации белков
трипсин золото, масс-спектрометрический класс	Promega	# V5280
50 мМ NH4HCO3	Bioshop	#AMC555
1 мМ CaCl2	Bioshop	#CCL302
ацетонитрил	сигма	#A998-4
муравьиный кислота	Sigma	#F0507
вода класса ВЭЖХ	Sigma	# 95304
Iodoacetamide	Sigma	# 16125
Millipore Zip-Tip	Millipore	# ZTC18M960
~10 см из 3 μ m Смола Luna-C18	Phenomenex
Proxeon nano HPLC насос	Thermo Fisher Scientific
LTQ Orbitrap Velos масс-спектрометр		Thermo Fisher Scientific
12. Лабораторная посуда
4 литровые конические колбы	VWR	#89000-372
50 мл полипропиленовые пробирки для сокола	Любой поставщик
1,5 мл микроцентрифужные пробирки	Любой поставщик
250 мл конические флаконы	VWR	#29140-045
15 мл стерильные пробирки для культивирования	Thermo Scientific	#366052
Криогенные флаконы	VWR	#479-3221-80
° C морозильная камера	Fisher Scientific	#13-990-14
Скоростная вакуумная система	Thermo Scientific
Буферы и растворы 1. 1 литр Потрясающего бульона (TB) media 11 г Bio-Tryptone 22 г Дрожжевой экстракт 2% Глицерин 50 мл калийного солевого бульона solution 2. Раствор калийной соли 1,5 M K2HPO4 0,35 M KH2PO4 3. Sonication Buffer 20 mM Tris-HCl (pH 7,9) 150 мМ NaCl 0,2 мМ EDTA 10% глицерин Перед использованием добавьте ингибитор протеазы (PI) и 0,1-0,5 мМ TCEP 4. AFC buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7,9) 150 mM NaCl 0,1% моющее средство Перед использованием добавьте PI и 0,1-0,5 mM TCEP 5. TEV расщепление буфер 30 mM Tris-HCl (pH 7,9) 150 мМ NaCl 0,2 мМ EDTA 0,1% моющее средство Перед использованием добавьте PI и 0,1-0,5 мМ TCEP 6. Кальмодулин-связывающий буфер 30 mM Tris-HCl (pH 7,9) 150 mM NaCl 2 mM CaCl2 0,1% моющего средства Перед использованием добавьте PI и 0,1-0,5 мМ TCEP 7. Буфер для промывки кальмодулина 30 mM Tris-HCl pH 7,9 150 мМ NaCl 2 mM CaCl2 0,1-0,5 мМ TCEP 8. Буфер для элюирования кальмодулина 30 mM Tris-HCl (pH 7,9) 100 мМ NaCl 10 мМ EGTA 0,1-0,5 мМ TCEP 9. Проявочный раствор (1л) <класс="jove_content">37% Формальдегид<бр/> 30 г карбоната натрия<бр/> 1000 мл дистиллированной воды <класс="jove_step">10. Буфер для разложения 50 mM NH4HCO3 1 mM CaCl2 11. Смачивающий и уравновешивающий раствор 70% ацетонитрил (ACN) в 0,1% муравьиной кислоте 12. Моющий раствор 100% H2O в 0,1% муравьиной кислоте