Покадровый Визуализация нейробластов миграции в остром ломтики мозга взрослых мышей

Summary

Мы описываем протокол реального времени videoimaging о миграции нейронов у мышей мозга. Миграция вирусно-меченных или привитые нейрональных предшественников был записан в остром живых срезов при использовании широкого поля флуоресцентных изображений с относительно быстрым приобретением интервал для изучения различных этапах клеточной миграции, в том числе продолжительность стационарного и миграции фазы и скорости миграция.

Abstract

Существует значительное количество доказательств, указывающих на то, что новые функциональные нейроны конститутивно генерируются из эндогенного пула нейральных стволовых клеток в ограниченных областях мозга взрослого млекопитающего. Новорожденные невобласты из субвентрикулярной зоны (СВЗ) мигрируют по ростральному миграционному потоку (РРС) к своему конечному пункту назначения в обонятельной луковице (ОБ)¹. В РРС нейробласты мигрируют тангенциально в цепочках, окаймленных астроцитарными процессами^2,3, используя кровеносные сосуды в качестве структурной поддержки и источника молекулярных факторов, необходимых для миграции^4,5. В OB нейробласты отделяются от цепей и мигрируют радиально в различные бульбарные слои, где они дифференцируются в интернейроны и интегрируются в существующую сеть^{1, 6}.

В этой рукописи мы описываем процедуру мониторинга миграции клеток в острых срезах мозга грызунов. Использование острых срезов позволяет оценить миграцию клеток в микроокружении, которое очень похоже на условия in vivo, и в труднодоступных областях мозга для визуализации in vivo. Кроме того, он позволяет избежать длительного культивирования, как в случае органотипических и клеточных культур, которые могут в конечном итоге изменить миграционные свойства клеток. Предшественники нейронов в острых срезах могут быть визуализированы с помощью оптики DIC или флуоресцентных белков. Вирусное мечение предшественников нейронов в SVZ, трансплантация нейробластов от мышей-репортеров в SVZ мышей дикого типа и использование трансгенных мышей, экспрессирующих флуоресцентный белок в нейробластах, являются подходящими методами визуализации нейробластов и отслеживания их миграции. Более поздний метод, однако, не позволяет отслеживать отдельные клетки в течение длительных периодов времени из-за высокой плотности меченых клеток. Мы использовали широкоугольный флуоресцентный вертикальный микроскоп, оснащенный ПЗС-камерой, для достижения относительно короткого интервала сбора данных (одно изображение каждые 15 или 30 секунд) для надежной идентификации стационарных и миграционных фаз. Точное определение продолжительности стационарной и миграционной фаз имеет решающее значение для однозначной интерпретации результатов. Мы также выполнили несколько наблюдений z-шага для мониторинга миграции нейробластов в 3D. Широкоугольная флуоресцентная визуализация широко используется для визуализации миграции нейронов^7-10. В этой статье мы подробно описываем протокол маркировки нейробластов, выполняем видеовизуализацию миграции нейробластов в острых срезах переднего мозга взрослой мыши в режиме реального времени и анализируем миграцию клеток. В то время как описанный протокол иллюстрирует миграцию нейробластов у взрослого человека RMS, он также может быть использован для отслеживания миграции клеток в эмбриональном и раннем постнатальном мозге.

Protocol

1. Маркировка нейрональных предшественников

Нейробластов могут быть визуализированы с использованием трансгенных мышей, которые выборочно выразить флуоресцентные белки в нейробластов (то есть, DCX-GFP, GAD67-GFP), по стереотаксически инъекционных вирусные частицы, кодирующие флуоресцентные белки в SVZ или RMS, или путем прививки нейрональных предшественников с корреспондентом мышей (то есть , DCX-GFP, GAD67-GFP) в SVZ из мышей дикого типа. Мы описываем процедуру прививки и вирусных маркировки нейрональных предшественников.

Диссоциация нейробластов из SVZ репортера мышей

1. Сл....

Discussion

Правильный нападения на нейрональных предшественников в соответствующие области мозга является одним из основных процессов, лежащих в основе правильной сборки и функции нервной системы. Подавляющее большинство клетки мигрируют в период эмбрионального развития и в послеродовом мозга лишь в нескольких регионах, таких как Обь, зубчатой ​​извилины и мозжечка, нейронные смещения по-прежнему имеет место. Механизмы оркестровки миграции клеток в постнатальном мозге остаются, однако, мало изучены. Знание механизмов и молекулярны.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге
Сахароза	Сигма	S9378
Глюкоза (ACSF)	EMD	DX0145-3
NaCI	Сигма	S9625
KCI	Сигма	P9541
MgCl 2 x6H 2 O	Sigma-Aldrich	M2670
NaHCO 3	Сигма	S5761
NaH 2 PO 4 хН 2 O	EMD	SX0710-1
CACI 2 x2h 2 O	Sigma-Aldrich	C3881
Декстран TexasRed	Invitrogen	D1864
Декстран CascadeBlue	Invitrogen	D1976
Глюкоза (40X раствор)	Сигма	G8769
Натрий pyruvat	Gibco	11360-070
HEPES	Сигма	H3375
HBSS	Gibco	14170-112
ДНКазы I	Сигма	D-5025
Трипсина-EDTA	Gibco	25300-054
Neurobasal среде	Gibco	21103-049
BSA	EMD	2930
Pen / Strep	Life Technologies	15140-122
Кетамин / Ксилазин	CDMV	5230
Пипетки Пастера	VWR	14672-380
15 мл коническую трубку	Sarstedt	62.553.205
50 мл коническую трубку	Sarstedt	62.547.205
Стеклянные капилляры (стереотаксической инъекции)	WPI	4878
Керосин	EMD	PX0045-3
Proviodine	Ружье	65655-1370
Шов	Stoelting	50487
Anafen	CDMV	11508
20 мл шприцев	VWR	SS-20L2
Чашка Петри	VWR	25384-094
Агар	Мат Laboratoire	AP-0108
Клей	Permabond	910
95% O 2/5% CO 2	Linde	24068835
Клинок	WPI	501901
Нейлоновая сетка	Warner Instruments	64-0198
Центрифугировать	Eppendorf	5702 000.019
Внесите съемника	Саттер инструменты	P-97
Nanoliter инжектор	WPI	B203MC4
Стереотаксическая аппарат инъекций	WPI	502900
Микро-системы буровой	WPI	501819
Vibratome	Thermo Scientific	920110
Широкое поле флуоресцентного микроскопа	Олимп	BX61WIF
ПЗС-камеры	Фотометрия	CS-HQ2-D
Ультра-тихий изображения камеры	Harvard Apparatus	64-1487
PH-1Серия 20 нагревателем платформы	Harvard Apparatus	64-0284
Система обогрева	Warner Instruments	TC-344B
40X цель погружением в воду	Олимп	1-UM587
10X цель погружением в воду	Олимп	1-UM583
Lambda DG-4	Sutter Instruments	DG-4/OF
MetaMorph программного обеспечения	Molecular Devices	40000
Imaris программного обеспечения	Bitplane	BPI-IM70-F1