Метод для загрузки субвентрикулярной зону (СВЗ) клеток кальцием индикатор красители для записи активности кальция описано. Послеродовой SVZ содержит плотно упакованных клеток, включая нервные клетки предшественники и нейробластов. Вместо того чтобы использовать ванну загрузки мы вводили красителя давление внутри тканей позволяет лучше красителя диффузии.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Подготовка Острый субвентрикулярной фрагменты зона для кальция изображений
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Субвентрикулярной зону (СВЗ) является одним из двух нейрогенных зон в постнатальном мозге. SVZ содержит плотно упакованных клеток, включая нервные клетки предшественники с астроцитов особенностей (так называемые SVZ астроциты), нейробластов и промежуточных клеток-предшественников. Нейробластов родился в SVZ касательной мигрировать на большие расстояния в обонятельную луковицу, где они дифференцируются в интернейронов. Межклеточной передачи сигналов через молекул адгезии и диффузии сигналы играют важную роль в борьбе с нейрогенеза. Многие из этих сигналов вызывают межклеточное деятельности кальция, который передает информацию внутри и между клетками. Кальций деятельности, таким образом, отражает активность внеклеточных сигналов и является оптимальным способом понять функциональное межклеточной сигнализации между клетками SVZ.
Кальций деятельность изучалась во многих других регионах и типах клеток, в том числе зрелые астроциты и нейроны. Тем не менее, традиционный метод, чтобы лоаг клеток кальцием индикатор красителя (например, ванны нагрузки) не был эффективным при загрузке всех типов SVZ клетки. Действительно, сотовая плотность в SVZ препятствует диффузии красителя в ткань. Кроме того, готовится сагиттальных будет лучше сохранить трехмерное расположение клеток СВЗ, в частности, поток миграции нейробластов на ростральной-каудальной оси.
Здесь мы опишем методы для подготовки сагиттальной разделов, содержащих SVZ, загрузка клетки SVZ с кальцием краситель индикатор, и приобретение кальция деятельность с покадровой фильмов. Мы использовали Fluo-4 утра краситель для загрузки SVZ астроциты с помощью давления приложения внутри ткани. Кальций деятельности был записан при помощи сканирующей конфокальной микроскопии позволяет точное разрешение для различения отдельных клеток. Наш подход применим и к другим нейрогенных зон, включая взрослого гиппокампа субгранулярной зоны и эмбриональных нейрогенных зон. Кроме того, другие виды красителей можетнаноситься с помощью описанного метода.
Протокол
1. Подготовка Solutions, Dissection, и Vibratome
- Решения должны быть готовы в нужный осмолярности и рН (табл. 1). По сравнению с искусственной цереброспинальной жидкости (ACSF), рассечение раствор готовят с более низкой концентрации натрия и кальция, а более высокие концентрации магния. Это необходимо для минимизации токсичности эффектов во время нарезки.
- Оба рассечения и ACSF решения должны быть насыщенным с 95% O 2/5% CO 2 при пропускании по крайней мере 10 минут, чтобы достичь желаемого рН 7,3.
- Подготовка ледяной бане в лоток. Место рассечения пластины в ледяной бане и заполнить с рассечением ре....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Кальций визуализации клеток SVZ была использована для изучения закономерностей в спонтанной активности в нейробластах 10, рецептор канала выражения в обоих нейробластов и астроциты 4,6,8 и астроцитов волны кальция 3. Так как клетки в SVZ либо незрелый или иметь глиальных свойства, они не срабатывают потенциалы действия 11,12, что означает, что миллисекунд изменения в напряжении потенциальных ориентировочной активности в зрелом сети не применимо в данном регионе. Таким образом,.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Эта работа была поддержана грантами NIH (DC007681, AB), CT стволовых клеток гранта (AB), Парди основания (AB), Predoctoral Рут Л. Kirschstein Национальный исследовательский службы Awards (НРСА) (SZY) и NSF аспирантуре Стипендия (BL). Мы благодарим членов Bordey лаборатории за полезные замечания по рукописи. Настоящий материал основан на работе частично поддержана штата Коннектикут под сотовый Коннектикут стволовых Программа исследовательских грантов. Его содержание несут исключительно авторы и не обязательно отражают официальную точку зрения штата Коннектикут, Департамент здравоохранения штата Коннектикут или КТ инноваций, Incorporated.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Растворенное вещество | Компания | Номер в каталоге | Dissection (мМ) |
| Сахароза | Сигма | S0389 | Dissection: 147 мм ACSF: 0 мм |
| NaCl | Сигма | S9888 | Dissection: 42 мм ACSF: 126 мм |
| KCl | Сигма | P3911 | Dissection: 2,5 мм ACSF: 2,5 мм |
| MgCl 2 .6 H 2 O | Сигма | M9272 | Dissection: 4,33 мМ ACSF: 1 мМ |
| NaH 2 PO 4. H 2 O | Сигма | S8282 | Dissection: 1,25 мм ACSF: 1,25 мм |
| Глюкоза | Сигма | G8270 | Диссеие: 10 мМ ACSF: 10 мМ |
| NaHCO 3 | Сигма | S6014 | Dissection: 26 мм ACSF: 26 мм |
| CaCl 2 · 2H 2 O | Сигма | C3306 | Dissection: 1,33 мм ACSF: 2 мм |
Таблица 1. Список химических и рецепты решения вскрытие и ACSF.
| [Заголовок] | |||
| Имя | Компания | Номер по каталогу | Комментарии |
| Vibratome | Leica | VT 1000S | |
| Super Glue | Surehold или 3M | Surehold 3G супер клей или 3M Vet-Бонд | |
| Dissection инструменты | Roboz или Ted Pella | ||
| Fluo-4 утра кальций-чувствительных красителей | Invitrogen | F14201 | |
| Орегон Зеленый ВАРТА-1 утра кальций-чувствительных красителей | Invitrogen | O6807 | |
| Pluronic F-127 20% раствора в ДМСО | Invitrogen | P3000MP | |
| Вертикальный конфокальной микроскопии | Олимп | FV300 или FV1000 | |
| Вода погружения цели | Олимп | LUMPlanFl 40 х W / IR (NA 0,80); LUMPlanFl 60 х W / I (NA 0,90) | |
| Микроманипуляторы | Sutter | MPC-200/MPC-325/MPC-385 | |
| <Регулятор давления/ TD> | Parker Hannifin | Picospritzer | <3 PSI во время нанесения |
| Внесите съемника | Саттер или Narshige | Саттер Р-97 или Narshige PP-830 | |
| Стеклянные пипетки | Sutter | BF150-110-10 | ID: 1,10, диаметр: 1,50 |
| Перистальтический | Harvard Apparatus | Модель 720 | Скорость потока: 1 мл / мин |
| Палата ванной | Warner Instruments | RC-26 GLP | Низкий профиль позволяет объективно оформление |
| Трубы | Tygon | ||
| Регулятор температуры | Warner Instruments | TC-324B/344B |
Таблица 2. Материалов / оборудования списка.
Ссылки
- Peretto, P., Giachino, C., Aimar, P., Fasolo, A., Bonfanti, L. Chain formation and glial tube assembly in the shift from neonatal to adult subventricular zone of the rodent forebrain. J. Comp Neurol. 487, 407-427 (2005).
- Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
