Метод переноса генов в куриных эмбрионах на более поздних стадиях инкубации (старше гамбургеров и Гамильтон этапе (HH) 22) описывается. Этот метод позволяет преодолеть недостатки В ово Электропорации применяемых к старым куриных эмбрионов и полезный метод изучения функций генов и регулирования в старших стадиях развития.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Перенос генов в старых куриных эмбрионов на
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Куриного эмбриона дает прекрасную модельную систему для изучения функций генов и регулирования в процессе эмбрионального развития. Ово электропорации это мощный метод более-экспресс экзогенных генов или вниз регулировать эндогенных генов в естественных условиях на куриных эмбрионах 1. Различные структуры, такие как ДНК, кодирующих генов плазмид 2-4 малых интерферирующих РНК (миРНК) плазмиды 5 небольших синтетических РНК олигонуклеотидов 6 и морфолино антисмысловых олигонуклеотидов 7 можно легко трансфекции в куриных эмбрионах путем электропорации. Тем не менее, применение в ово электропорации ограничивается эмбрионов на ранних стадиях инкубации (моложе этап HH20 - в соответствии с Гамбургом и Гамильтон) 8 и есть некоторые недостатки в его применении у эмбрионов на поздних стадиях (старше этап HH22 - около 3,5 дня развития). Например, желточной оболочки на более поздних стадиях УрГУсоюзника застряли с мембраной должна и открыть окно в оболочке вызывает разрыв сосудов, что приводит к гибели эмбриона, старший эмбрионов покрыты желточного и аллантоисной суда, где трудно получить доступ и управлять эмбрионов; старше эмбрионов двигаться энергично и трудно контролировать ориентацию через относительно небольшое окно в оболочке.
В этом протоколе мы демонстрируем бывший ово метод электропорации для переноса генов в куриных эмбрионов на поздних стадиях (старше этап HH22). Для бывших ово электропорация, эмбрионы культивировали в чашках Петри, 9 и желточного и аллантоисной судах широко распространены. В этих условиях, чем старше куриных эмбрионов легко доступны и манипулировать. Таким образом, этот метод устраняет недостатки в ово электропорации применяется к старшему куриных эмбрионов. Используя этот метод, плазмиды могут быть легко трансфекции в разных частяхстаршего куриных эмбрионов 10-12.
Протокол
1. Ex ово культуры
- Свежие оплодотворенные яйца откладываются на их длинной стороне в принудительной проект инкубатора (BSS160, Эрет, Германия) на 37,5 ° С, влажности 60% для инкубации. Яйца хранились при температуре 12 ° С в течение более одной недели, не должны использоваться.
- После инкубации в течение 2,5 дней (около этап HH17), вынуть яйца и маркировать сверху карандашом, чтобы указать направление для взлома.
- До трещин, залить 20 мл стерильной дистиллированной воды в чистую большой чашке Петри (диаметром 145 мм; Greiner Bio-One GmbH, Германия).
- Установите еще один небольшой стерильной чашке Петри (диаметром 94 мм, Greiner Bio-One GmbH) в большой чашке Петри.
- Трещина яйца на нижнюю против острые края металла, осторожно откройте яйца и передать все содержимое каждого яйца в небольшой чашке Петри.
- Накройте большой чашке Петри с крышкой и поместить его в другой инкубатор (BINDER GmbH, Tuttlinge, Германия)для дальнейшей культуры в 37,5 ° C около 60% влажности. После инкубации в течение нужное количество дней, эмбрионы могут быть использованы для электропорации.
2. Подготовка к бывшим ово Электропорация
- Потяните стеклянных капилляров с микроэлектрода съемник (ПУЛ-100 микропипетки Puller, инструменты Всемирной Precision, Берлин, Германия) с использованием стеклянных трубок 1,0-мм (TW100F-4; инструменты Всемирного Precision) и разбить кончик стеклянные капилляры в соответствующие диаметре.
- Настройте соответствующие параметры (например, различные напряжения для различных тканей и размеров эмбрионов) для электропорации и подключения электродов электропоратора (CUY21-Edit, Непско генов, Чиба, Япония) в соответствии с целевым тканям и размеры эмбрионов.
- Подготовить раствор, содержащий плазмиду плазмид в векторном pCAGGS кодирования генов-мишеней, например, cadherin7 (Cad7; pCAGGS-Cad7 с концентрацией 2,0 мкг / мкл) и маркерный ген,например, зеленый флуоресцентный белок (GFP, pCAGGS-GFP при концентрации 0,25 мкг / мкл). Затем добавить Быстрый зеленый с конечной концентрации 0,1% (Sigma) для обозначения плазмиды решение с зеленым цветом.
- Загрузите стеклянный капилляр с плазмиды решения с использованием рот пипеткой.
3. Перенос генов в куриный оптический Tectum экс ово Электропорация
- После того, как бывший ово культуры, например, путем инкубации день (E) 6 куриных эмбрионов, которая используется для ово электропорации.
- Тщательно разорвать желточного и амнион мембраны на оптические покрышки с мелким щипцы и добавить 3 капли стерильного 0,9% раствора хлорида натрия на поверхности покрышки.
- Вводите плазмиды раствора в полость покрышки от стеклянного капилляра используя рот пипеткой.
- Установите электроды с вольфрамовым катодом иглы и анод прямоугольника пластины (СиУ 661-3х7, Непско Gene) рядом покрышки, исразу же применять электрические импульсы (шесть импульсов, 25 V, 60 мс длительность импульса 100 мс интервалов в каждом конкретном случае), производимых электропоратора на покрышки.
- Накройте большой чашке Петри с крышкой и вернуть его в инкубаторе. После инкубации в соответствующие дни (например, 2 или 3 дня после электропорации), покрышки собираются и фиксируются в иммунной (рис. 1) и биологические обнаружения.
4. Представитель Результаты
Успешное гиперэкспрессией экзогенного белка GFP Cad7 и экс ово электропорации показано на рисунке 1 в качестве примера. Когда Cad7 плазмиды вместе с GFP плазмида электропорации в покрышки на E6, два или три дня после электропорации эмбрионы были собраны и закреплены. В E8, белок GFP сильно выражено в покрышки в целом изображение горы (рис. 1А-C). Кроме того, в разделах покрышки на E9,GFP белка (зеленый на рисунке 1D) и Cad7 белка (красный рис 1E) являются coexpressed (желтый рис 1F), предполагая, что бывший ово электропорации является успешным методом для переноса генов в старших куриных эмбрионов в естественных условиях.
Рисунок 1. Когда плазмиды кодирования GFP и Cad7 которые cotransfected в куриных покрышки на E6, два или три дня после того, как бывший ово электропорация, GFP белка (зеленый) сильно выражено, как показано на wholemount изображений (АС) в Е8. В разделах покрышки на E9, GFP белка (зеленый D) и Cad7 белка (красный Е) coexpressed (желтый F). BF, яркое поле изображения. Масштаб по сайту: 200 мкм для переменного тока, 100 мкм, D для DF.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Этот протокол представляет собой руководство для переноса генов в старые куриных эмбрионах (например, в оптических покрышки на E6) экс ово электропорации. Этот метод расширяет возможности использования электропорации пожилых куриных эмбрионов и могут быть легко применены для многих лабораториях для изучения функций генов в естественных условиях на более поздних этапах. Эмбрионы с E4, по крайней мере E7 может быть успешно электропорации этим методом и электропорации эмбрионы могут быть выживания до E15 ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Эта работа была поддержана грантом от немецкого исследовательского фонда (DFG, LU1455/1-1).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Имя | Компания | Номер в каталоге | |
| Электропоратора | Непско генов, Япония | CUY21-Edit | |
| Электроды | Непско генов, Япония | CUY661-3x7 | |
| Яйцо инкубатор | Эрет, Германия | BSS160 | |
| Эмбрион инкубатор | BINDER GmbH, Германия | ||
| Флуоресцентный микроскоп | Keyence, Deutschland GmbH | BZ-8000 | |
| Чашка Петри | Greiner Bio-One GmbH, Германия | ||
| Микроэлектродные съемник | Всемирный точных приборов, Германия | ПУЛ-100 |
Ссылки
- Momose, T., Tonegawa, A., Takeuchi, J., Ogawa, H., Umesono, K., Yasuda, K. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Dev. Growth Differ. 41, 335-344 (1999).
- Luo, J., Ju, M. J., Lin, J., Yan, X., Markus, A., Mix, E., Rolfs, A., Redies, C. Cadherin-20 expression by motor neurons is regulated by Sonic hedgehog during spinal cord development. NeuroReport. 20, 365-370 (2009).
- Luo, J., Ju, M. J., Redies, C. Regionalized cadherin-7 expression by radial glia is regulated by Shh and Pax7 during chicken spinal cord development. Neuroscience. 142, 1133-1143 (2006).
- Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation. Mech. Dev. 121, 1137-1143 (2004).
- Dai, F., Yusuf, F., Farjah, G. H., Brand-Saberi, B. RNAi-induced targeted silencing of developmental control genes during chicken embryogenesis. Dev. Biol. 258, 80-90 (2005).
- Rao, M., Baraban, J. H., Rajaii, F., Sockanathan, S. In vivo comparative study of RNAi methodologies by in ovo electroporation in the chick embryo. Dev. Dyn. 231, 592-600 (2004).
- Kos, R., Tucker, R. P., Hall, R., Duong, T. D., Erickson, C. A. Methods for introducing morpholinos into the chicken embryo. Dev. Dyn. 226, 470-477 (2003).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88, 49-92 (1951).
- Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos. Dev. Biol. 10, 391-394 (1974).
- Luo, J., Treubert-Zimmermann, U., Redies, C. Cadherins guide migrating Purkinje cells to specific parasagittal domains during cerebellar development. Mol. Cell. Neurosci. 25, 138-152 (2004).
- Luo, J., Redies, C. Ex ovo electroporation for gene transfer into older chicken embryos. Dev. Dyn. 233, 1470-1477 (2005).
- Treubert-Zimmermann, U., Heyers, D., Redies, C. Targeting axons to specific fiber tracts in vivo by altering cadherin expression. J. Neurosci. 22, 7617-7626 (2002).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
