Этот протокол позволяет выявить факторы, которые модулируют функциональную бета клеточной массы, чтобы найти потенциальных терапевтических мишеней для лечения сахарного диабета. Протокол состоит из обтекаемой метод оценки репликации островок и функции бета-клеток островков в изолированных крыс после манипуляций экспрессии генов с аденовирусов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Оценка репликации и функции бета-клеток в Adenovirally-трансдуцированных изолированных островков грызунов
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Гомеостаза глюкозы в первую очередь контролируется инсулином эндокринных гормонов и глюкагон, который вырабатывается в поджелудочной бета-и альфа-клетки, соответственно. Функциональные клеточной массы бета определяется анатомическими клеточной массы бета, а также способность бета-клеток в ответ на биогенной нагрузки. Потеря функциональной клеточной массы бета занимает центральное место как основные формы сахарного диабета 1-3. В то время как снижение функциональной бета клеточной массы результате аутоиммунной атаки на сахарный диабет 1 типа, при диабете 2 типа, это уменьшение развивается как с неспособностью бета-клетки секретируют инсулин должным образом и разрушения бета-клеток из кадровых механизмов. Таким образом, усилия по восстановлению функциональной бета клеточной массы имеют огромное значение для лучшего лечения и потенциальных методов лечения диабета.
Ведется работа по выявлению молекулярных путей, которые могут быть использованы, чтобы стимулировать репликации и повышению функции бета-клеток.В идеале, терапевтических целей позволит улучшить как бета-клеточный рост и функцию. Возможно, более важно, хотя это определить, является ли стратегия, которая стимулирует рост клеток бета происходит за счет нарушая функцию бета-клетки (например, с некоторых онкогенов), и наоборот.
Путем систематического подавления или гиперэкспрессией выражение целевых генов в изолированных островков крысы, можно выявить потенциальных терапевтических мишеней для повышения функциональной клеточной массы бета 4-6. Аденовирусных векторов могут быть использованы для эффективного гиперэкспрессией или нокдаун белка в изолированных островков крысы 4,7-15. Здесь мы представляем способ манипулировать экспрессии генов использования аденовирусной трансдукции и оценить островок репликации и функции бета-клеток островков в изолированных крыс (рис. 1). Этот метод был использован ранее для определения новых целей, которые модулируют бета репликации клетки или функции 5,6,8,9,16,17.
Протокол
1. Аденовирусные трансдукция и культивирования Крысы островков
- Подготовка 6-и не-культуры тканей покрытием пластины, добавив 2 мл среды (RPMI 1640 средах, содержащих 8 мМ глюкозы, 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 50 ед / мл пенициллина, 50 мкг / мл стрептомицина) для необходимого количества скважин. Например, типичный эксперимент может потребовать трех скважин - по одной для не-Virus Control, вирус управления (например, GFP-экспрессирующих аденовирус), а в экспериментальной группе.
- Теплые пластины до 37 ° C, поместив его в культуре ткани инкубатор, по крайней мере 30 мин.
- Сразу же после крысы островок изоляции 18,19, мес....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Создание путей, которые можно модулировать по стимулированию репликации и повышению функции бета-клеток имеют отношение к обоим основные формы сахарного диабета. Поскольку функциональные клеточной массы бета зависит от существования и функционирования инсулин клетки, оценки этих детерминант одновременно имеет свои преимущества. Этот протокол описывает обтекаемый протокол для выявления ли гиперэкспрессия или подавление белка приводит к изменению функциональной клеточной массы бета-версии в пробирке, которые зате.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Эта работа была поддержана грантом DK078732 из NIH (в ПТФ).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Название реагента | Компания | Номер по каталогу | Комментарии |
| RPMI 1640 средств массовой информации | Гибко | 11879 | |
| Пенициллина / стрептомицина | Гибко | 15140 | |
| 6-луночного планшета | BD-Сокол | 35-1146 | Non-TC лечение |
| [Метил-3 H]-тимидина | Перкин Элмер | NET027Z001MC | 1 мКи / мл |
| Micro-пробирок | Denville | C2170 | 1,7 мл |
| NaCl | Сигма | 59888 | |
| KCl | Acros | 42409 | |
| KH 2 </ SUB> PO 4 | Acros | 20592 | |
| MgSO 4 | Acros | 41348 | |
| CaCl 2 | Acros | 34961 | |
| HEPES | Сигма | H0887 | 1 М раствора |
| 35% BSA | Сигма | A7979 | |
| NaHCO 3 | Acros | 42427 | |
| D-глюкозы | Сигма | G8769 | |
| TCA | Fisher Scientific | SA9410-1 | 10% вес / объем |
| NaOH | Acros | 12426 | |
| Сцинтилляционных счет трубы | Sarstedt | 58,536 | 7 мл, ПП |
| Сцинтилляционных счет трубы колпачок | Sarstedt | 65,816 | |
| Econo-Safe считая коктейль | RPI | 111175 | |
| Инсулин РИА | Сименс | TKIN2 | |
| BCA Анализ Kit | Thermo Scientific | 23250 | |
| Оборудование | |||
| Центрифугировать | Эппендорф | 5415R | |
| Сцинтилляционных счет трубы стойки | Sarstedt | 93.1431.001 | |
| Жидкий сцинтилляционный счетчик | Перкин Элмер | Tri-Carb 2910TR |
Ссылки
- Ferrannini, E. beta-Cell function in subjects spanning the range from normal glucose tolerance to overt diabetes: a new analysis. J. Clin. Endocrinol. Metab. 90, 493-500 (2005).
- Weyer, C., Bogardus, C., Mott, D. M., Pratley, R. E.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
