Оценка репликации и функции бета-клеток в Adenovirally-трансдуцированных изолированных островков грызунов

Summary

Этот протокол позволяет выявить факторы, которые модулируют функциональную бета клеточной массы, чтобы найти потенциальных терапевтических мишеней для лечения сахарного диабета. Протокол состоит из обтекаемой метод оценки репликации островок и функции бета-клеток островков в изолированных крыс после манипуляций экспрессии генов с аденовирусов.

Abstract

Гомеостаза глюкозы в первую очередь контролируется инсулином эндокринных гормонов и глюкагон, который вырабатывается в поджелудочной бета-и альфа-клетки, соответственно. Функциональные клеточной массы бета определяется анатомическими клеточной массы бета, а также способность бета-клеток в ответ на биогенной нагрузки. Потеря функциональной клеточной массы бета занимает центральное место как основные формы сахарного диабета ^1-3. В то время как снижение функциональной бета клеточной массы результате аутоиммунной атаки на сахарный диабет 1 типа, при диабете 2 типа, это уменьшение развивается как с неспособностью бета-клетки секретируют инсулин должным образом и разрушения бета-клеток из кадровых механизмов. Таким образом, усилия по восстановлению функциональной бета клеточной массы имеют огромное значение для лучшего лечения и потенциальных методов лечения диабета.

Ведется работа по выявлению молекулярных путей, которые могут быть использованы, чтобы стимулировать репликации и повышению функции бета-клеток.В идеале, терапевтических целей позволит улучшить как бета-клеточный рост и функцию. Возможно, более важно, хотя это определить, является ли стратегия, которая стимулирует рост клеток бета происходит за счет нарушая функцию бета-клетки (например, с некоторых онкогенов), и наоборот.

Путем систематического подавления или гиперэкспрессией выражение целевых генов в изолированных островков крысы, можно выявить потенциальных терапевтических мишеней для повышения функциональной клеточной массы бета ^4-6. Аденовирусных векторов могут быть использованы для эффективного гиперэкспрессией или нокдаун белка в изолированных островков крысы ^4,7-15. Здесь мы представляем способ манипулировать экспрессии генов использования аденовирусной трансдукции и оценить островок репликации и функции бета-клеток островков в изолированных крыс (рис. 1). Этот метод был использован ранее для определения новых целей, которые модулируют бета репликации клетки или функции ^{5,6,8,9,16,17.}

Protocol

1. Аденовирусные трансдукция и культивирования Крысы островков

1. Подготовка 6-и не-культуры тканей покрытием пластины, добавив 2 мл среды (RPMI 1640 средах, содержащих 8 мМ глюкозы, 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 50 ед / мл пенициллина, 50 мкг / мл стрептомицина) для необходимого количества скважин. Например, типичный эксперимент может потребовать трех скважин - по одной для не-Virus Control, вирус управления (например, GFP-экспрессирующих аденовирус), а в экспериментальной группе.
2. Теплые пластины до 37 ° C, поместив его в культуре ткани инкубатор, по крайней мере 30 мин.
3. Сразу же после крысы островок изоляции ^18,19, мес....

Discussion

Создание путей, которые можно модулировать по стимулированию репликации и повышению функции бета-клеток имеют отношение к обоим основные формы сахарного диабета. Поскольку функциональные клеточной массы бета зависит от существования и функционирования инсулин клетки, оценки этих детерминант одновременно имеет свои преимущества. Этот протокол описывает обтекаемый протокол для выявления ли гиперэкспрессия или подавление белка приводит к изменению функциональной клеточной массы бета-версии в пробирке, которые зате.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер по каталогу	Комментарии
RPMI 1640 средств массовой информации	Гибко	11879
Пенициллина / стрептомицина	Гибко	15140
6-луночного планшета	BD-Сокол	35-1146	Non-TC лечение
[Метил-3 H]-тимидина	Перкин Элмер	NET027Z001MC	1 мКи / мл
Micro-пробирок	Denville	C2170	1,7 мл
NaCl	Сигма	59888
KCl	Acros	42409
KH 2 </ SUB> PO 4	Acros	20592
MgSO 4	Acros	41348
CaCl 2	Acros	34961
HEPES	Сигма	H0887	1 М раствора
35% BSA	Сигма	A7979
NaHCO 3	Acros	42427
D-глюкозы	Сигма	G8769
TCA	Fisher Scientific	SA9410-1	10% вес / объем
NaOH	Acros	12426
Сцинтилляционных счет трубы	Sarstedt	58,536	7 мл, ПП
Сцинтилляционных счет трубы колпачок	Sarstedt	65,816
Econo-Safe считая коктейль	RPI	111175
Инсулин РИА	Сименс	TKIN2
BCA Анализ Kit	Thermo Scientific	23250
			Оборудование
Центрифугировать	Эппендорф	5415R
Сцинтилляционных счет трубы стойки	Sarstedt	93.1431.001
Жидкий сцинтилляционный счетчик	Перкин Элмер	Tri-Carb 2910TR